Замена масла лада гранта: Лада Гранта — замена масла и масляного фильтра двигателя — журнал За рулем — Запчасти Владивосток | Автозапчасти Владивосток

Содержание

Лада Гранта — замена масла и масляного фильтра двигателя — журнал За рулем

Замену масла в двигателе Лада Гранта выполняем в соответствии с регламентом технического обслуживания через каждые 15 тыс. км пробега автомобиля.

Устанавливаем автомобиль на смотровую канаву или эстакаду. Замену масла выполняем на неработающем прогретом двигателе, лучше сразу после поездки, пока масло не остыло.

На 16-клапанном двигателе доступ к масляному фильтру сверху отсутствует, поэтому для замены фильтра снизу необходимо снять средний грязезащитный щиток моторного отсека. Посмотреть, как выполнить эту работу, можно в статье «Заменяем охлаждающую жидкость Lada Granta».

2015-12-21_111120

Снимаем крышку маслозаливной горловины двигателя.

Снизу автомобиля очищаем от грязи поддон картера вокруг пробки сливного отверстия.

1

Головкой или накидным ключом «на 17» ослабляем затяжку пробки сливного отверстия.

Подставляем под отверстие широкую емкость для отработанного масла.

4

Отвернув пробку вручную, сливаем масло.

Внимание! Будьте осторожны — масло горячее и агрессивно для кожи.

Сливаем масло до тех пор, пока оно не начнет капать из сливного отверстия. Протерев пробку и удалив с ее резьбы оставшуюся грязь, заворачиваем пробку на место. Удаляем подтеки масла с поддона картера двигателя. Подставляем емкость для отработанного масла в зону расположения масляного фильтра и отворачиваем его, вращая против часовой стрелки. Если это не удалось сделать вручную, используем съемник. Чтобы при этом не повредить жгут проводов датчика и сам датчик положения коленчатого вала,..

45

…отсоединяем колодку жгута от разъема датчика и отводим жгут проводов в сторону от фильтра.

455

Ослабляем затяжку фильтра съемником, отворачиваем…

4555

…и снимаем масляный фильтр.

На 8-клапанном двигателе для слива масла грязезещитный щиток не снимаем. Заодно покажем и еще один вариант пробки, которой может быть закрыто сливное отверстие в поддоне картера.

45556

Шестигранником «на 12» отворачиваем пробку сливного отверстия…

455568

…и сливаем масло в подставленную емкость.

Масляный фильтр доступен сверху. Не забываем отсоединить наконечник проводов от датчика сигнализатора недостаточного давления масла. Отворачиваем (против часовой стрелки) масляный фильтр. Если это не удается сделать вручную,..

4555685

…ослабляем затяжку фильтра съемником…

55685

…и вынимаем масляный фильтр.

При отсутствии съемника пробиваем корпус фильтра отверткой (ближе к донышку, чтобы не повредить штуцер двигателя) и отворачиваем фильтр, используя отвертку в качестве рычага. Очищаем посадочное место фильтра на блоке цилиндров от загрязнений и потеков масла. Заливаем в фильтр новое моторное масло примерно на половину объема фильтра и наносим тонкий слой масла на уплотнительное кольцо фильтра. Масляный фильтр заворачиваем от руки до соприкосновения уплотнительного кольца с блоком цилиндров. Доворачиваем фильтр еще на 3/4 оборота для герметизации соединения. Через маслозаливную горловину заливаем в двигатель 3,2 л масла и заворачиваем крышку горловины.

Внимание! Если ваш автомобиль укомплектован автоматической коробкой передач, то емкость системы смазки двигателя составляет 4,4 л.

Пускаем двигатель на 1–2 мин. Убеждаемся, что в комбинации приборов погас сигнализатор недостаточного (аварийного) давления масла в двигателе и отсутствуют потеки из-под пробки сливного отверстия и из-под фильтра. Останавливаем двигатель и через несколько минут (чтобы масло успело стечь в поддон картера) проверяем уровень масла в поддоне картера. При необходимости доводим уровень масла до нормы, подтягиваем масляный фильтр и резьбовую пробку сливного отверстия.

[14 операций по техобслуживанию Lada Granta, которые помогут вам сэкономить]

[Как сэкономить на плановом ТО Lada Granta] [Техническое обслуживание Lada Granta на 2,5 тыс. км пробега] [Техническое обслуживание Lada Granta на 15 000 и 105 000 км пробега] [Техническое обслуживание Lada Granta на 30 000 и 60 000 км пробега] [Техническое обслуживание Lada Granta на 45 тыс. км пробега] [Техническое обслуживание Lada Granta 75 тыс. км пробега] [Техническое обслуживание Lada Granta на 90 тыс. км пробега] [Самостоятельное проведение ТО — общие рекомендации] [Правила техники безопасности при самостоятельном проведении ТО] [Инструмент, необходимый для проведения техобслуживания Lada Granta] [Лампы, применяемые в автомобиле Lada Granta]

Порядок замены масла Гранты (в двигателе) — «Клуб-Лада.рф»

Когда менять масло Лада Гранты? По рекомендации завода изготовителя, первая замена масла на Гранте после покупки автомобиля или капитального ремонта двигателя должна производиться через 2,5-3тыс.км. пробега. Далее, масло в двигателей следует менять один раз в год или через каждые 15 000 км. пробега, в зависимости от того, что наступит раньше.

А Вы знаете, как поменять масло в Гранте своими руками?

Потребуется: загнать автомобиль на эстакаду (двигатель должен быть прогрет до рабочей температуры), приготовить ключ «на 17», съемник масляного фильтра, большую отвертку и тару не менее 4л.

Чтобы слить моторное масло потребуется:

Отвернуть крышку маслозаливной горловины.
Очистить снизу поверхность вокруг пробки сливного отверстия на масляном картере.
Подставить под отверстие для слива отработанного масла емкость объемом не менее 4л.
Отвернуть пробку сливного отверстия, используя накидной ключ «на 17». Осторожно, масло горячее!
Сливать моторное масло в течении 10 минут.
Завернуть пробку и очистить поддон картера от потеков масла.

Теперь следует снять масляный фильтр. Подставляем под фильтр емкость. Отворачиваем масляный фильтр Гранты против часовой стрелки, используя съемник. Если нет съемника масляного фильтра, тогда можно использовать отвертку в качестве рычага, пробив ей корпус фильтра (ближе к дну, чтобы не повредить штуцер двигателя).

Перед установкой масляного фильтра нужно залить в него новое моторное масло, наполним его до половины объема. Затем смазать этим же маслом уплотнительное кольцо масляного фильтра и завернуть фильтр вручную до соприкосновения уплотнительного кольца с блоком цилиндров. После этого довернуть еще на 3/4 оборота.

Сколько масла в двигателе Гранты? Объем масла в системе смазки двигателя 3,5л., но около 0,5л. масла все равно остается в моторе, поэтому заливаем через маслозаливную горловину примерно 3л. нового масла. Заворачиваем крышку горловины по часовой стрелке.

Запускаем двигатель на 1-2 мин и убеждаемся, что в комбинации приборов погас сигнализатор недостаточного (аварийного) давления масла в двигателе и потеки из-под пробки и фильтра отсутствуют.

Проверка. Останавливаем двигатель, ждем несколько минут, чтобы масло стекло в поддон картера и проверяем уровень масла Гранты, используя щуп. При необходимости доводим уровень до нормы (между метками «MIN» и «MAX»). При необходимости подтягиваем масляный фильтр и резьбовую пробку сливного отверстия.

Замена масла в двигателе Гранты выполняется без помощника в течении 15-20 минут. Процедура несложная, однако, выполнив ее самостоятельно можно лишиться гарантии. Если описанный выше процесс не ясен, тогда можете посмотреть видео по замене масла в Гранте:

Кстати, а Вы знаете, какое моторное масло лучше выбрать?

Ключевые слова:

Понравилась статья? Поделитесь с друзьями!

Замена масла в двигателе ЛАДА «Гранта» (Фото и Видео)

Своевременная замена масла в ЛАДА “Гранта” — обязательное условие надежной и долгой работы силового агрегата. Поменять масло можно как самостоятельно, так и на специализированном СТО. Последний вариант имеет смысл, если автомобиль находится на гарантии производителя. В других случаях проще. дешевле и быстрее заменить моторное масло самостоятельно.

Функции мотоного масла

Кроме смазки подшипников, без которой они не проработали бы какое-либо значимое время. масло выполняет несколько функций, каждая из которых достойна отдельного рассмотрения:

смазка трущихся частей, особенно подшипников скольжения коленвала и вала ГРМ;
отвод излишков тепла от мест трения для дополнительного увеличения ресурса деталей;
очистка деталей поршневой группы и механизма газораспределения от нагара и копоти;
образование защитного слоя, защищающего детали двигателя во время запуска, когда давление масла отсутствует.

Почему необходимо менять масло в двигателе “Гранта”

В результате работы двигателя масло “стареет”: в нем накапливаются загрязнения, присадки “срабатываются”, взаимодействуя с металлическими деталями, воздухом и продуктами горения. Само масло постепенно окисляется, теряя свойства и переставая выполнять перечисленные выше функции. “Старое” масло:

хуже отводит тепло, подшипники перегреваются и интенсивней изнашиваются;
теряет смазывающие свойства, что приводит к увеличению трения в подшипниках и в цилиндрах;
уменьшает свои защитные антикоррозийные свойства;
накапливает продукты сгорания, забивая ими масляные каналы.

В результате ресурс двигателя существенно сокращается, возникает вероятность преждевременного выхода из строя подшипников с последующим капитальным ремонтом двигателя. Поэтому необходима своевременная замена масла в двигателе “Гранта”.

Как часто нужно менять масло

Периодичность замены зависит не от временного интервала, а от пробега автомобиля. Первая замена масла на ЛАДА “Гранта” производится после пробега 3000 км. Это связано с тем, что двигатель должен пройти обкатку. Последующие замены следует выполнять через 10-15 тысяч километров.

Какое масло необходимо заливать в ЛАДА “Гранта”

Согласно рекомендациям конструкторов ВАЗ, моторное масло для “Гранта” должно соответствовать группам SL или SJ согласно классификации API, а его вязкость — климатическим условиям и особенностям эксплуатации автомобиля.

Сколько масла необходимо заливать

Популярная “Гранта” выпускается в двух вариациях — с ручной и автоматической КПП. В первом случае при замене понадобится примерно 3,2 литра масла, во втором — 4,2 литра.

Примечание: система смазки вмещает несколько большее количество масла, но при замене часть старого масла остается в двигателе.

Что необходимо для замены масла

Чтобы поменять масло, необходимо иметь доступ к сливному отверстию снизу двигателя. Поэтому замена производится на смотровой яме или подъемнике.

Примечание: на специализированных СТО замена масла может производиться при помощи вакуумного маслоотсоса, которые удаляет масло не через сливное отверстие, а через места установки щупа.

Также понадобится:

новый масляный фильтр;
достаточное количество соответствующего моторного масла;
накидной ключ на 17, чтобы открутить сливную пробку;
воронка для заливки масла;
съемник масляного фильтра;
ветошь;
емкость для отработанного масла.

Как поменять масло двигателя ЛАДА “Гранта”

Замена масла в двигателе “Гранта” производится следующим образом:

Замена масла в ЛАДА “Гранта” завершена. Можно отправляться в путь.

Замена масла в двигателе Лада Гранта 16 клапанов своими руками на видео

Заменить масло в двигателе Lada Granta способен каждый даже неопытный автомобилист. Машина имеет удачную конструкцию, проверенную временем еще со времен Lada Kalina. В этой статье даны рекомендации по правильной замене моторной жидкости, на основании которых каждый для себя сделает вывод, что что подобная процедура доступна любому даже начинающему владельцу Lada Kalina с 16-клапанным двигателем.

Нюансы замены масла

Перед тем, как что-либо менять, в первую очередь надо убедиться в необходимости замены. Как известно, оптимальный регламент для замены моторного масла для Lada Kalina составляет 15 тысяч километров. После такого количества пробега масло не успеет потерять свои полезны свойства. Таким образом, можно будет избежать преждевременного износа деталей. Если тянуть с заменой, тогда можно столкнуться с необратимыми проблемами в силовой установке. Поэтому замена осуществляется каждые 15 тысяч км, что является оптимальным регламентом с учетом сложных климатических и дорожных условий в России.

Лучшее моторное масло. существует ли оно?

Какое масло заливать

Главное, чтобы моторная жидкость соответствовала стандартам SJ и SL по классу API. Данная маркировка гарантирует качество изделия, в котором можно не сомневаться. Что касается параметров вязкости и допуска, они должны соответствовать тем сведениям, которые указаны в инструкции по эксплуатации к Lada Kalina.

Выделим перечень качественных моторных масел для Lada Kalina

Лукойл Люкс
Новайл Супер
Роснефть Максимум
Роснефть Премиум
ТНК Магнум Супер
Татнефть Ультра Оптима
Экстра
G-Energy S Synth

Какие нужны материалы для замены

Набор инструментов, включая головки и ключи
Воронка для залива новой жидкости
Емкость для слива отработанной жидкости
Полотенце, резиновые перчатки
Новое моторное масло
Новый масляный фильтр
Фонарик

Приступаем к замене масла

Автомобиль устанавливается на эстакаду. В крайнем случае, вместо нее можно использовать домкрат и высокие опоры под колеса. Запускаем двигатель и прогреваем до рабочей температуры, затем выключаем зажигание
Забираемся под яму, и находим сливное отверстие, плотно закрытое пробкой. Доступ к нему будет затруднен из-за защиты картера. Сперва снимаем ее, затем откручиваем пробку. Пробку снимаем постепенно, после чего наблюдаем процесс стекания отработанного масла в заранее подготовленный поддон
Пока будет сливаться масло, приступаем к следующему этапу – демонтажу старого масляного фильтра. Скорее всего, он будет грязным и изношенным, поэтому его придется заменить на новый аналог. Для этого сначала выкручиваем старый фильтр, повернув его на 20-30 мм. В этот момент стечет немного масла. Далее необходимо вокруг фильтра установить ключ с ремнем, и ослабить на пол-оборота. После этой процедуры фильтр можно без особых усилий открутить руками, а ключ уже не понадобится
После того, как стекло старое масло, закручиваем обратно пробку
Протираем и обезжириваем все поверхности от масляных подтеков, проверяем надежность крепления всех винтовых соединений
Устанавливаем новый фильтр, затем ставим на место защиту картера
Следующий этап – залив нового моторного масла. Данный процесс производится в подкапотном пространстве. Находим заливное отверстие, откручиваем ее и заливаем свежую жидкость. Для удобства можно использовать воронку
После залива масла закрываем обратно пробку, и запускаем двигатель. В этот момент на приборной панели включается лампа масляного давления, которая через некоторое время должна погаснуть сама
Еще раз проверить днище автомобиля на наличие утечек
Выключить двигатель, и отрегулировать уровень залитой жидкости. Необходимо, чтобы он находился на уровне между отметками Max и Min на мерном щупе. При необходимости понадобится долить или слить немного жидкости. При достижении оптимального уровня процесс замены масла в 16-клапанной двигателе Lada Kalina успешно завершен.

Видео

Замена масла в двигателе Лады Гранта с пошаговой инструкцией выполнения работ

Срок эксплуатации автомобиля Лады Гранта зависит от многих факторов — марки и модели, частоты использования, дорог, по которым он передвигается и ухода за ним. О последнем поговорим подробнее, ведь от этого зависит не только как долго прослужит ваш железный конь, но и комфорт водителя. Смазочные материалы играют далеко не последнюю роль в качестве функционирования автомобиля, поэтому не стоит тянуть с их заменой, если возникла такая необходимость. Как поменять масло в двигателе Лада Гранта своими силами и по каким параметрам понять, пора ли? Об этом мы сегодня и поговорим.

Содержание статьи

Когда менять?

Ранее фирма-производитель заявляла, что замена масла в двигателе Лада Гранта должна впервые (после покупки или полного ремонта двигателя) осуществляться через три тысячи километров пробега, но позже эта рекомендация была изъята из регламента.

Тем не менее опыт многих автолюбителей показал, что это требование было указано не зря, и по срокам оно является оптимальным. А дальше в процессе эксплуатации рекомендуемый срок использования моторной смазки — один год или пробег в десять-пятнадцать тысяч километров. Также учитывайте, что промежутки между заменами зависят еще от ряда факторов — интенсивности пользования автомобилем, качества дорожных покрытий, простоя в пробках и климатических условий.

При суммарном превалировании неблагоприятных показателей замену масла необходимо производить несколько чаще, приблизительно через каждые семь-восемь тысяч километров.

Какой расходник брать?

Завод-изготовитель дает четкие рекомендации по смазочным материалам, которые наилучшим образом подходят для Лада Гранта. Лучше всего ознакомиться с перечнем и выбрать смазочный материал из него. Конечно, допускается использование только масел высокого качества и только тех марок, которые хорошо себя зарекомендовали. Также следует обратить внимание на вязкость приобретаемой продукции — она будет зависеть от климатических условий, в которых предполагается использование автомобиля.

Необходимый инвентарь

Прежде чем приступить к работе, позаботьтесь о необходимом инструменте и оборудовании.

Понадобится:

Масло. Объем: 3 литра. Вообще для Лада Гранта необходимо 3.5 л смазочного материала, но отработанный расходник удалить полностью не удастся, около полулитра останется в моторе.
Комплект ключей. Понадобится гаечный ключ на 17 и ключ для отворачивания масляного фильтра.
Тара для сбора отработанного расходника. Подойдет старое ведро или таз.
Ветошь для очищения поддона.
Гараж со смотровой ямой, эстакада или домкрат.

Порядок работ

Перед заменой масла в двигателе вашей Лада Гранта прогрейте ее — достаточно проехать 10-15 километров.

Загоните авто в гараж со смотровой ямой/на эстакаду или поднимите домкратом.
Проверьте двигатель и масло: последнее должно быть горячим, мотор — прогретым и выключенным.
Поместите под сливное отверстие тару объемом 4-5 литров (не меньше!), в нее будет собираться отработанный материал.
Возьмите накидной ключ, открутите пробку сливного отверстия. Будьте аккуратны — пробка обычно завинчена на совесть, не повредите ее излишними усилиями.
Дайте маслу стечь — для этого необходимо как минимум десять минут. Чтобы процесс шел быстрее, можно извлечь щуп и открутить пробку залива масла.
На задней части двигателя необходимо найти масляный фильтр и заменить его. Особых усилий в большинстве случаев не требуется — поворачивайте его против часовой стрелки, он удаляется руками; если же отвернуть его проблематично, воспользуйтесь специальным приспособлением для снятия фильтра.
Очистите ветошью посадочное место от старой прокладки.
Возьмите новый фильтр, смажьте его новым маслом и вкручивайте его руками на место. Когда уплотнительное кольцо соприкоснется с блоком цилиндров, поверните масляный фильтр еще на три четверти оборота.
Возвращаем назад сливную пробку на поддон и вкручиваем ее, вставляем обратно щуп.
Переходим непосредственно к заливке моторного масла. Залейте масло в заливное отверстие, закрутите горловину пробкой по часовой стрелке.

Тестирование. Запустите двигатель на пару минут. Проверьте, не подтекает ли масло в области фильтра и сливной пробки, не горит ли сигнализатор недостаточного давления масла. Остановите мотор, дайте маслу стечь в картер. Проверяем уровень масла: если отметка находится между минимальным и максимальным значением, все в порядке. Если обнаружены подтеки, или уровень масла вызывает сомнения, подтяните пробку сливной горловины и масляного фильтра.

На этом процесс замены завешен. Желательно отработанный материал не сливать в землю, а использовать его снова в каких-либо технических целях.

Овладение этими несложными навыками может уберечь авто от поломок, а вас от лишних трат в автосервисе. Для осуществления всех действий достаточно будет получаса, даже если вы делаете это впервые. Не забывайте следить за состоянием своего автомобиля, грамотно и своевременно за ним ухаживать и производить замену расходных материалов, если это необходимо.

Видео: замена моторного масла в Лада Гранта

Как заменить масло и фильтр двигателя Лада Гранта

Проверку уровня масла в двигателе нужно делать перед поездкой.

Если проверяем масло, после того как двигатель работал, нужно подождать чтобы масло стекло в картер двигателя.

Вынимаем щуп уровня масла.

Протираем его ветошью и вставляем в штуцер блока цилиндров до упора.

Снова вынимаем щуп и по кромке масляной пленки определяем количество масла в поддоне двигателя.

Верхняя кромка масляной пленки должна находиться между метками MIN и MAX.

Между метками примерно 1 литр масла.

Доливаем масло если количество меньше или равно MIN.

Откручиваем крышку маслозаливной горловины

Доливаем масло в двигатель

Доливаем масло той же марки, что и было залито в двигатель.

Доливая масло нужно не допускать заливки масла выше нормы. Избыток масла может привести к выводу из строя каталитический нейтрализатор.

Замена масла и масляного фильтра двигателя

Через каждые 15 тысяч пробега автомобиля нужно заменять масло в двигателе.

Подготавливаем автомобиль для выполнения работы.

Устанавливаем автомобиль на смотровую канаву или подъемник.

Для выполнения работы понадобятся: емкость для слива отработавшего масла, ветошь, головку на 17 или шестигранник на 12 (зависит от пробки сливного отверстия).

Подставляем емкость для слива масла и ключом ослабляем пробку сливного отверстия

До конца рукой откручиваем пробку сливного отверстия и сливаем масло

Протираем пробку и смотрим наличие стружки на магните пробки.

Заворачиваем пробку (на пробке коническая резьба, нужно затягивать, не перетягивая пробку).

Откручиваем масляный фильтр.

Масляный фильтр откручиваем съемником (рис. 7).

Если съемника нет и фильтр сильно закручен, можно пробить масляный фильтр отверткой, ближе к дну фильтра и как рычагом открутить фильтр.

Извлекаем масляный фильтр. Очищаем посадочное место фильтра.

Заливаем в фильтр небольшое количество масла и смазываем резиновую прокладку фильтра.

Масляный фильтр закручиваем от руки.

Заливаем через заливную горловину масло в двигатель 3,2 литра масла и заворачиваем крышку горловины.

Запускаем двигатель, сигнализатор аварийного давления в комбинации приборов должен погаснуть.

Проверяем наличие потеков масла из под фильтра и из под сливной пробки масляного поддона.

Останавливаем двигатель и проверяем уровень масла в двигателе, как описано выше.

Доводим уровень масла до нормы.

Подтягиваем масляный фильтр и сливную пробку.

В систему смазки двигателя входит 3,5 литра масла.

Моторные масла (с уровнем качества API SJ, SL, SM): SAE 0W-30; SAE 0W-40; SAE 5W-30; SAE 5W-40; SAE 10W-30; SAE 10W-40; SAE 15W-40; SAE 20W-50

Замена масла в двигателе Лада Гранта

На чтение 3 мин. Просмотров 37k. Опубликовано

13.01.2016 Обновлено 19.

05.2021

Регулярная замена масла, согласно рекомендациям завода изготовителя, обеспечит двигателю автомобиля стабильную работу без дополнительного износа и, как следствие, сокращения его ресурса. Произвести замену масла можно как самостоятельно, так и обратившись в специализированный сервис.

Если автомобиль на гарантии, лучше произвести замену у дилера. Не стоит экономить на масле, от него напрямую зависит износ двигателя.

Когда менять моторное масло на Гранте

Замена моторного масла на Гранте производится каждые 10-15 тыс км пробега. Именно в течении этого времени масло обладает всеми необходимыми свойствами для смазки узлов двигателя. Далее масло начинает чернеть и становится более жидким, то есть теряет вязкость.

Если у вас новая Лада Гранта, замену масла следует произвести после 3 тыс км пробега. Далее замена производится каждые 10-15 тыс км пробега.

Сроки замены масла зависят от эксплуатации вами автомобиля, некоторые за год проезжают по 30-50 тыс км и соответственно меняют его по 4-5 раз в год. Другие лишь 10-20 тыс, соответственно производят замену моторного масла на Гранте всего 1-2 раза в год.

Какое масло заливать в двигатель Лада Гранта

Завод изготовитель рекомендует следующие масла: Mobil 1, ShellHelix, Лукойл, Роснефть, Татнефть и другие соответствующие характеристикам вязкости масла. Решение, какое именно масло приобрести и заливать решаете вы, завод АвтоВАЗ дает лишь рекомендации, с которыми можно ознакомится на рисунках ниже.

Отличия замены масла в 8 и 16 клапанном моторе на Гранте

Замена масла на 8 и 16 клапанных моторах практически одинакова. Отличия лишь в том, что на 16 клапанном моторе невозможно сверху снять масляный фильтр. Для его замены потребуется открутить среднюю защиту(поддона). В остальном же никаких отличий нет.

Имейте в виду! При замене масла – замена масляного фильтра обязательна!

Сколько масла необходимо залить в двигатель Гранты

Если у вас Лада Гранта с 8кл или 16 клапанным мотором и механической кпп, вам необходимо залить объем – 3,2 литра масла. Если у вас автоматическая кпп, необходимый объем – 4,4 литра масла.

Инструкция по замене масла на Гранте с 8 и 16 кл мотором

Итак, откручиваем крышку масляной горловины. Далее ослабляем затяжку сливной пробки на поддоне.

Подставляем под нее тару для слива старого масла. Сливаем его до тех пор, пока масло не начнет капать мелкими каплями.

Далее подставляем тару под масляный фильтр и с помощью съемников откручиваем его. Для удобства замены советуем отсоединить колодку датчика коленвала, чтобы случайно не повредить ее съемником.

Если под рукой нет съемника, можно аккуратно пробить масляный фильтр отверткой и открутить его, используя отвертку как рычаг.

После того как мы полностью слили старое масло и открутили фильтр, берем новый фильтр и наливаем в него примерно до половины новое масло, а так же смазываем уплотнительное резиновое кольцо маслом. Заворачиваем фильтр.

Если вы меняете тип масла или заливаете масло другой фирмы, необходимо выполнить промывку двигателя специальным промывочным маслом.

Заливаем новое масло через горловину. С механической кпп 3,2 литра с автоматом 4,4 литра.

Подождем несколько секунд и запускам мотор. На панели загорится лампа индикации уровня масла. Через минуту лампа погаснет. На этой процесс замены завершен. Необходимо лишь проверить уровень и при необходимости выполнить доливку.

Как проверить уровень масла в Гранте

После того, как мы поменяли масло в двигателе, запустили двигатель и он немного поработал, подождем пока масло сольется в поддон и проверим его уровень.

Достаем масляный щуп и смотрим уровень. Он должен находится на отметке между min и max. При необходимости доливаем масло и радуемся проделанной работе.

Ремонт и обслуживание Лада Гранта.

Все, что вам чертовски известно о Лада Грант Лифтбек Техническое обслуживание Лада Грант DIY

Автовладельцам нужно усвоить, что в первую очередь не следует снижать расход бензина на Лада Грант, а стараться не допускать лишнего топлива. Необходимо понимать, что если ваша машина в достойном состоянии, ни модификаторы, ни прокладки не помогут. Мы постарались вывести общую формулу, позволяющую максимально экономно относиться к вопросу расхода топлива на […]

Когда мы проводили тест-драйв новой Лады Гранты, сюрприз поджидал дополнительный сигнальный брелок. Вопреки заверениям сотрудников автосалона, при первом нажатии на кнопку брелока мы обнаружили, что Lada Grant не заводится. Только с третьей попытки завелся двигатель Лады. Однако здесь нет претензий к АвтоВАЗу, скорее к установщикам дополнительного оборудования. С момента удаленного запуска с […]

Недавно шахта новая Lada Грант проходил техническое обслуживание в интервале 2000-3000 км.Ее одометр показал чуть больше 2400 км. При первом техническом обслуживании автосервис «Лада Грант» проводит «контрольные работы» и «диагностические операции», профилактические работы включают замену масла и масляного фильтра в ДВС. Так же возможен ремонт техобслуживания жигулей на гранте, при необходимости. Кроме того, это было […]

Через некоторое время после выпуска новой машины — гранты Lada представителями издательского дома «Водитель Петербург» был проведен тест-драйв российского автомобиля «New Production». концерн АвтоВАЗ.Тест-драйв, к сожалению, был поднят по техническим причинам. Первые поломки были обнаружены у Lada Lada Grant, а если точнее — у щитка передней части автомобиля. После обнаружения такого дефекта управление […]

Базовая комплектация Lada Grant стоит 229 тысяч рублей, а цена самой инжекторной версии — 260 тысяч рублей. Из чего следует, что конкурировать с этой машиной на российском рынке практически некому. Подвеска этого автомобиля — это совокупность узлов, механизмов и деталей, играющих роль звена, соединяющего кузов автомобиля с дорогой. Сегодня подвеска становится […]

Нам удобнее

Багажник на гранте большой, много чего закрывает, а эти вещи часто лежат хаотично. Решил исправить несложным методом. Купил липучку и широкую резинку. Она сшила их и прикрепила к стене. Выглядит это так: автор этого, так сказать, удобство Zero52rus с сайтом DRIVE2 из Нижнего Новгорода

Установка доп. Оборудование

В Лада Грант в графтах «Норма» 21900-41-013 и 21900-41-014 нет топ заказов.Казалось бы, мелочь, но нет. Многие люди, Севжа в машине автоматически к ним тянутся, и … вместо поручней хватает воздуха … Для установки можно использовать поручни для автомобиля ВАЗ2110. Десятки поручней выглядят довольно красиво и по цвету подходят к внутренней отделке. Не забываем про […]

Установка доп. Оборудование

Скоро лето, а значит, начнутся жаркие, мучительные дни. Ощущения особенно неприятны, когда садишься в машину, которая стояла на солнышке, а оттуда уходит тепло! Не машина, а баня какая-то! В Plus запахи пластика и других материалов, тонущих на солнце, просто выбиваются из своей прочности. Горячие кресла, руль — нахожусь в […]

Установка доп. Оборудование

После покупки машины, пусть и не всегда новой, хочется держать ее в руках, уберечь от нападения хулиганов, от угона или порчи. Учитывая то, что машина стоит недешево, защиту от угона желательно поставить на примере автосигнализации. Мы уже рассматривали защиту автомобиля от угона в виде иммобилайзера для грантов Lada. Прочтите о ней […]

Установка доп. Оборудование

Автомобили Лада Грант имеют аудиоподготовку, то есть с завода есть какие-то детали, упрощающие установку аудиосистемы. На штатной подготовке проводов только к головке аудиоподготовки на Лада Гранта комплектации «Стандарт» — жгут силовых проводов подключается к головному устройству, то есть подводящие провода есть только у магнитолы. . Специально подготовленных проводов на дверях нет.На проводе стандарт […]

Для Lada Grant очень актуален, ведь детище отечественного автопрома, как ни прискорбно, не радует своих владельцев сверхлюдьми. Тем более, что отечественный автомобилист явно не ищет легких путей, поэтому в большинстве случаев и решается ремонт своими руками. В связи с этим на просторах русскоязычного Интернета существует своеобразный клуб автолюбителей, где счастливые обладатели Lada-Granta делятся опытом и секретами в этом непростом деле.И такой клуб не одинок.

Никто не будет спорить с тем, что, приступая к такому ответственному делу, как ремонт собственного авто своими руками, нужно иметь хороший багаж знаний по данной теме. Таким источником технической информации будет книга. В нем можно найти подробное описание очень большой суммы. технические проблемы и поломки.

Правильная диагностика неисправности

Для начала необходимо провести качественную диагностику неисправностей автомобиля.Однако вряд ли у клуба простых «пацанов» есть для этого в гараже дорогостоящее оборудование. Чтобы купить такой диагностический прибор, придется немало потратиться. А оно того стоит? Большинство автомобилистов делают выводы на основании собственных ощущений и наблюдений за своими автомобилями. Конечно, такой поверхностный анализ не может дать максимально точного вердикта, но, обратившись к ремонтной книжке, можно довольно точно определить тип большинства, не прибегая к дорогостоящим услугам на сотню.

Например, в этой книге вы найдете признаки неисправности двигателя и других элементов агрегатной системы. Если вы заметили громкий шум при запуске стартера, хлопок во впускной трубке, выстрелы в глушитель, сильную вибрацию двигателя или повышенный расход масла, то в упомянутой выше книге будут указаны первые причины устранения неисправностей, а также советы, которые поможет исправить эти поломки.

В этом своеобразном справочнике вы найдете ответы и советы на многие вопросы.Например, коленчатый вал не проворачивается стартером, двигатель работает нестабильно, перегревается агрегат — все эти и многие другие проблемы будут перечислены в справочнике.

Здесь вы найдете описание и решение проблем, связанных с шасси автомобиля, трансмиссией, рулевым управлением и тормозной системой. Заклинивание сцепления, стуки при работе подвески, шум в момент переключения передачи, вибрация при движении автомобиля, утечка масла — вот краткий перечень тех проблем, которые описаны в книге.

Ремонт своими руками

С диагностикой все понятно. Если вы нашли проблему и определили ее причину, то как быть, если речь идет о самостоятельном ремонте? Здесь вам пригодится такая книга, как «Руководство по ремонту Lada-Granta». Вот и ремонт двигателя, и сцепления, и коробки передач, и прочее. Вы можете найти поэтапную, подробную и предельно понятную инструкцию, которая поможет вам решать задачи разной сложности. Например, очень подробно в книге описана замена всевозможных датчиков и замена двигателя.Кроме того, там вы найдете пошаговые инструкции по ремонту тормозной системы, электрооборудования и многих других систем. Еще одно огромное преимущество — четкие, четкие и цветные иллюстрации. Все это значительно упростит процесс ремонта различных систем в автомобиле.

Такие преимущества можно довольно легко найти во всемирной паутине, где они доступны для бесплатного скачивания. Также не стоит забывать о сервисной книжке, которая прилагается самим производителем, в ней можно найти много полезной информации по ремонту «Жигулей».Видеоуроки — это просто бесценный материал, потому что они позволяют увидеть все в действии. Именно такой подход наиболее эффективен для абсолютных новичков.

Внешний вид этого автомобиля, а точнее даже не он сам, а информации о нем ждали абсолютно все. И даже тем, кто даже не задумывается о своей покупке при покупке ни при каких обстоятельствах. Удивлен? В конце концов, речь идет не о наиболее пострадавшем суперкаре или следующем внедорожнике премиум-класса.Речь идет о максимально дешевой компактной машине. Эх Лада Грант Лифтбек.

Чем вызван такой интерес к довольно обыденному с точки зрения мира автомобилю автомобилю? Исключительно внешний вид Лада Грант Лифтбек . Дошло до того, что многие журналисты и автомобильные эксперты удостоили Элефбека самой красивой отечественной машины. И доля правды в этих смелых заявлениях есть. Если сравнивать гранту с проклятыми приорами и калиной, то действительно красиво смотрится на их фоне.А вот с иномарками гранта Лифтбек сейчас не сравнить. И все благодаря идеально подобранным пропорциям. Вот как не хватало отечественных машин. И в конце концов, дело не в том, что дизайнеры должны были просто следить за тем, чтобы их работа радовала глаз. Ради привлекательного внешнего вида пришлось изменить форму некоторых кузовных панелей, что явно не понравилось инженерам и технологам. Но заводчане пошли на такой шаг. И все для покупателей.

Нареканий нет, если не забыть и о стоимости машины, и о салоне.И пусть все сделано из дешевого жесткого пластика, но с точки зрения дизайна все не так уж и плохо. Симпатичный трехпланкерный руль, лаконичная комбинация приборов, показания с которых читаются за секунды, скромные, но вполне удобные блоки управления аудиосистемой и микроклиматом — все это дарование Лифтбека также предложит даже самым богатым. конфигурация. Что ж, если вы научитесь платить дополнительно, вы сможете полюбоваться большим цветным дисплеем, который займет большую часть передней панели.

Сзади места Лада Грант Лифтбек Места ровно столько, сколько в седане. Только зазор над головой стал буквально на пару сантиметров меньше, но вряд ли пассажиры смогут это почувствовать. И даже если могут, то не стоит утомлять создателей машины. Красота требует жертв, и ради такой красоты жертвовать незначительным уменьшением пространства над головой не только можно, но и нужно. Ради дизайна пожертвовал и багажник. А точнее не их самому, а доступ к нему.Красивые задние фонари Немного сузили проем багажника. Было хуже? Напротив! Ведь это не седан, а лифтбэк, в котором поднимается не маленькая крышка багажника, а все заднее стекло. Доставить огромные коробки некуда. Да и сам объем багажника удовлетворит практически любого автомобилиста — 430 литров. А если сложить задние сиденья сзади, в вашем распоряжении будет и вовсе 750 литров свободного места.

И если по дизайну Грант Лифтбек он отличный от машины с кузовом седан, то в техническом плане изменений заметно меньше.Так что двигатели нам уже знакомы. Базовый — это бензиновый восьмерично-плавильный агрегат объемом 1,6 литра, развивающий 87 лошадиных сил. С ним предлагается только механическая коробка Shift. Но с более мощным «шестнадцатантантаном» объемом 1,6 литра, который дает 98 или 106 «лошадей», можно заказать не только «механику», но и коробку автомат Shift.

Лада Леди Грант Лифтбек пусть не ну, но достойно. Его вполне можно сравнить с бюджетными иномарками. Но будущий владелец должен знать, что управляемость и уровень комфорта во многом будут зависеть от комплектации автомобиля.Если вы выберете самую дорогую технику, в которой помимо прочего будут шикарные легкосплавные диски из низкопрофильной резины, то будьте готовы к тому, что машина будет достаточно жесткой, чтобы преодолевать все неровности. Но управляемость хорошая. А вот на основных штампованных дисках и резине с высоким профилем Грант Лифтбек идеален для регионов, которые не могут похвастаться идеально ровными дорогами. Энергоемкости подвеска не займет, а высокопрофильная резина избавит от постоянной пробежки с мелкими неровностями.

Конструктивные дефекты автомобиля можно исправить без сотки. Ремонт Лада Гранта производится только после ознакомления с характеристиками модели.

Лада Гранта (ВАЗ-2190) — российский автомобиль В классе. Выпуск модели начался в октябре 2011 года.

Лада

Лада Гранта создана на платформе Лада Калина 2004 года выпуска.

Модели

состоят на 70% из одинаковых деталей и компонентов. Технически гранта практически ничем не отличается от прародителя. Производители увеличили колесную базу и отвод задних колес, растянули переднюю часть автомобиля.

Модификации Lada Granta

Lada Grant выпускается в трех модификациях.

Стандарт. Самая дешевая модификация модели. Выпуск с 82-сильным 8-клапанным двигателем. Из-за конструктивных особенностей у автовладельцев возникают неудобства вождения. При разгоне сложно справиться. Есть проблемы с трансмиссией и сцеплением.
Норм. ВАЗ-2190 в комплектации «Норма» оснащается 8-клапанным силовым агрегатом мощностью 87 л.из. Рулевое управление Рулевое управление с электроусилителем и управляемая рулевая колонка.
Люкс. Оснащение отличается салоном повышенной комфортности и 98-сильным 16-клапанным двигателем.

Все модификации имеют отрицательный развал колеса.

Двигатели

Двигатели ВАЗ-2190 комплектуются поршневой системой. При обрыве ремня ГРМ клапаны гнутся и поршень ломается. Важно своевременно провести диагностику силового агрегата.

Выход из строя генераторов — обычная неисправность моделей. Замена генератора требуется после 1000 км пробега.

Коробка передач

Через 20 000 км КПП запускает вызывной сигнал и начинает гудеть. Переключатели без нареканий, но трос ручника нужно постоянно подтягивать.

Шасси

Производитель устанавливает угол развала задней подвески в 1 градус. В процессе эксплуатации в регулировке нет необходимости.Ходовые качества Лада Гранта невысокие. Для улучшения характеристик потребовался капитальный ремонт конструкции шасси.

Модификации Lada Grant стандартно комплектуются шинами AMTEL Planet-2P. Шины отличаются низкими сцепными свойствами.

Салон

Салон Лада Гранта вместительный. Уровень шумоизоляции — плохо смонтированные дефлекторы системы вентиляции. Регулировки сидений по высоте нет, индикаторов температуры двигателя нет.

Доработка Lada Granta

Для устранения заводских неполадок модель тюнингована.

Технический тюнинг лучше начинать с поиска неисправности топливной системы. Нужно установить кронштейны крепления топливопровода, закрепить гофры комбайнов.

Тюнинг внешнего вида можно совместить с улучшением аэродинамических свойств Авто и оснастить Ладу обвесом Гранта.

Новая Лада 2170.

прочно занял свое место на отечественном авторынке и выходит на передовые позиции по количеству продаж за год. Новый АвтоВАЗ порадовал любителей комфортных поездок с небольшими затратами. Прототип бюджетной иномарки более доступен российскому потребителю, но может оказаться не таким долговечным.

Продукция отечественного автопрома выгодна тем, что в случае поломки и необходимости замены с легкостью ее можно найти на любом авторынке. Если у вас есть автомобиль Лада Грант, вы можете отремонтировать его своими руками в собственном гараже, без дополнительных затрат на автосервис. Главное — наличие подходящего инструмента.

Как ни печально, но ничто не вечно. А в автомобилях Лада Грант возникают небольшие неисправности и большие поломки. Какой ремонт можно сделать своими руками, не прибегая к помощи профессиональных мастеров?

Замена поврежденных автозапчастей

Демонтаж маховика проводится в нескольких случаях: замена заднего сальника, поломка венца шестерни, шлифовка поверхности маховика под ведомый диск сцепления. Для начала нужно снять коробку передач. Для удобства дальнейшей сборки деталей рекомендуется походное расположение коленвала и маховика.

Болты, крепящие маховик, надавите на устройство, чтобы не переключались. Состояние зубов оценивается визуально. На поверхности не должно быть заусенцев. Для удобства оценки рекомендуется провести пальцем по поверхности. Неисправный маховик заменяется новым, деталь устанавливается на место.

Прокладка защищает двигатель от ухода моторного масла и охлаждающей жидкости, и ее следует заменять на новую не только при поломке, но даже при каждом вмешательстве в блок цилиндров, поскольку оно считается разовым.

Замену удобнее всего проводить сразу после остановки автомобиля, в это время давление значительно снижается. Поршень первого цилиндра выставлен в положение такта сжатия не более. Клемма «массы» снимается с АКБ и сливается охлаждающая жидкость. Фильтр забора воздуха демонтирован. Отсоедините колодку жгута проводов, свечей и проводов, а также датчики перепада давления масла и температуры охлаждающей жидкости.

После всех этих несложных процедур можно заменить прокладку и подключить все агрегаты в обратном порядке.

Перед заменой подшипника нужно снять коробку передач и фиксатор сцепления. Затем муфту можно будет снять с конструкции. На Лада Грант подшипник в основном совмещен с муфтой, но один подшипник можно заменить. Для этого потребуется разобрать саму муфту, сжимая стопорные лапы любым подходящим инструментом.

Устанавливать подшипник нужно аккуратно, учитывая наличие части динамика, которая предназначена для удерживающего кольца.После устранения неисправности можно собирать коробку передач в обратной последовательности и устанавливать все на место.

Особенности замены элементов сцепления

Для замены адгезионной вилки понадобятся шпильки и отвертка. Для начала необходимо демонтировать подшипник включения и снять с рычага резиновый пыльник, который, пользуясь случаем, можно заменить на новый. Лепестки фиксатора прижимают к основанию прохода и снимают втулку с оси вилки, затем снимают ось самой вилки, сжатой в втулке картера. С заглушки снять пружинный фиксатор.

Замена троса сцепления

Если втулка подверглась значительному износу, ее можно заменять до тех пор, пока не будет демонтирована вся система. В процессе установки недопустимо ослабление гильзы внутри паза, так как это может привести к ее выпадению. Собрать всю конструкцию следует в обратном порядке.

Перед тем, как приступить к работе со сцеплением, его следует выключить, выдавливая подходящие для этого приспособления лепестки.Замена кабеля выполняется в определенной последовательности.

Под панелью приборов Внутри салона нужно открутить гайку с упора.
Отсоедините пластиковый корпус с помощью отвертки или другого предоставленного инструмента, который касается стержня педали.
Из оболочки кабеля и разъема в моторном отсеке Снимите уплотнение и потяните кабель вперед. Снимите с его вилки выемку.
От наконечника сменного кабеля открутите провод и снимите оболочку кабеля.
Новый кабель пропустить в отверстие и закрепить на кронштейне.
Закрепите на пятке этого кронштейна упор и установите уплотнение на место.
В отверстие для кронштейна протолкнуть новый трос и вставить втулку.
Прикрутите провод к нижнему наконечнику.

Замена деталей тормозной системы

Ремонт тормозного цилиндра Grant

Неисправности тормозной системы могут привести к образованию отложений, и чтобы этого избежать, необходимо периодически проводить диагностику.Если поломки выявлены, их следует немедленно устранять. При наличии неисправностей автомобиль Лада Грант эксплуатировать не следует.

Признаков, по которым можно выявить неисправность тормозных цилиндров:

барабаны на великолепном кожухе показывают, что тормозная жидкость проходит через уплотнения и течет наружу;
машина не катится по инерции при захвате поршней.

Для замены тормозных цилиндров необходимо установить автомобиль в нужное положение, включить понижающую передачу и поставить упор под колеса. Отвинтите от цилиндра тормозную трубку и закройте ее колючими средствами, чтобы предотвратить утечку тормозной жидкости. Отделите цилиндр от кожуха, открутив два болта. Новый цилиндр устанавливается в обратном порядке.

При замене передних колодок на автомобиле Лада Грант такая последовательность действий соблюдается.

Перед тем, как приступить к работе, нужно выключить аккумулятор. Определите уровень тормозной жидкости, и если она находится возле горловины бачка — откачайте. Загните край нижнего болта стопорной шайбы.
Выкрутите нижний болт крепления кронштейна корпуса.
Поверните корпус скобы к оси болта.
Снимите колодки, перемещая поршни механизма отверткой или другим подходящим предметом.
Очистите механизм и снимите боковой демонтаж колодки.
При установке новых колодок поршень помещается в цилиндр, при этом постоянно следят за уровнем тормозной жидкости, не допуская ее перетекания через кромку.

Колодки тормозные задние Поменять после снятия барабана и разборки есть там проливы.

Снимите верхнюю и нижнюю пружины стяжки и направляющую пружину с подушки.
Снимите расширенную планку и выведите рычаг из петли троса.
Уберите палец.

Установка новой задней колодки выполняется в обратном порядке.

Ремонт многих деталей автомобиля Лада Гранта можно выполнить самостоятельно. А для тех, кто раньше пользовался другим автомобилем от АвтоВАЗа и уже занимался устранением его неисправностей, это совсем не составит труда, так как многие детали и механизмы у машин Вазов идентичны.

Не волнуйтесь! 10 вещей, которые вы должны знать о ладах

Тед Дроздовски

07.05.2012

Лады легко принять как должное. Они входят в стандартную комплектацию каждой гитары и не имеют такого «вау» фактора, как инкрустации или рисунки под дерево. Неудивительно, что многие игроки мало обращают на них внимания — пока что-то не пойдет не так.

Эти банальные полосы из металлической проволоки невероятно важны, когда речь идет о играбельности, атаке, тоне и других факторах.Вот 10 вещей, которые вам нужно знать о ладах:

• Как работают лады: Фактическое рассмотрение того, что делает каждая часть вашей гитары, а не просто принятие ее присутствия, может привести к ценным открытиям.

Прижатие струны к ладу уменьшает длину вибрации этой струны до расстояния между точкой давления и бриджем, тем самым контролируя высоту тона. Почти на каждом западном ладовом инструменте расстояние между ладами составляет полутон одинаковой темперации, что обеспечивает легкое получение сильных аккордов и отдельных нот, которые соответствуют обычным ожиданиям нашего полушария в отношении ритмических звуков и мелодий.Понимание достоинств и ограничений, создаваемых порядком ладов, открывает двери для способов избежать их ограничений, таких как сгибание струн, игра на слайде, использование ударных стержней, углубление в расширенную технику или опробование безладовых инструментов.

• Из чего они сделаны: Лады обычно изготавливаются из никель-серебряного или никелево-стального сплава или, что реже, латуни, медного сплава или нержавеющей стали. Чем тверже и плотнее материал, с нержавеющей сталью наверху и мягким никелем внизу, тем ярче и резче должны звучать ноты, сыгранные на гитаре.Большинство производителей используют никелевые сплавы, потому что металл мягкий и с ним легко работать. К этому моменту уши большинства гитаристов также приспособлены к никелевому звучанию, и большинство покупателей гитар имеют тенденцию не обращать внимания на незнакомое при покупке инструментов.

• Как проверить лады: Самый простой и быстрый способ убедиться, что лады гитары находятся в хорошей форме, — это посмотреть прямо на гриф гитары, от корпуса до грифа. Если лады находятся на разной высоте (в случае с новыми гитарами виновата неправильная установка) или перекосились, возникают проблемы.Они должны выглядеть одинаково и иметь как можно меньше вмятин или износа.

• Почему размер имеет значение: Ширина и высота ладов значительно влияют на игровые возможности. Длина ладовой проволоки составляет от 0,078 до 0,110 на макушке или вершине, а высота — от 0,035 до 0,055. Более высокие лады, от 0,45 и выше, как правило, облегчают сгибание струны и дают четкие ноты без особого давления. Последнее делает их идеальными для высокоскоростной игры. Дальнейшей точкой этой концепции является зубчатый гриф, который наиболее заметно использовали Ингви Мальмстин и Джон Маклафлин, игравшие на специально разработанном Gibson J-200 с зубчатыми ладами и дрон-струнами с группой Shakti.

Некоторые быстрые сборщики предпочитают короткие лады для быстрой работы с грифом. Все дело в вкусе и стиле, хотя гитары с низким ладом также производят более мягкий звук. Gibson Les Paul Custom — классический тому пример.

Есть также школа исполнителей, которые предпочитают широкие лады, обычно от 0,100 до 0,110, для улучшения интонации. Широкие лады изнашиваются медленнее, чем узкие, поэтому они дольше сохраняют все свои свойства, в том числе способность точно воспроизводить ноты.

• Как износ влияет на удобство игры: Износ ладов — бороздки на ладах из-за давления на струны, углубления, создаваемые изгибом, снижение общей высоты лада в результате использования — все это может вызвать жужжание в местах расположения ладов. шея.К счастью, эти проблемы обычно можно решить, выровняв и одев лады несколько раз, прежде чем потребуется замена лада, поскольку замена лада является дорогостоящей.

• Почему концы ладов становятся острыми: Иногда конец лада может стать острым или, точнее, выступать по бокам шеи гитары. Помимо шероховатости на руках, это показатель более сложной проблемы: гриф стал сухим и сморщенным. Это означает, что гитара хранилась в среде с недостаточной влажностью.Более бережное хранение — лучший ответ, но использование лимонного масла на грифе также помогает предотвратить это, увлажняя древесину.

• Как лады влияют на действие: Обычно это дело вкуса, техники и носки. Некоторым игрокам, которые обнаруживают, что они сталкиваются с сопротивлением при сгибании струн, могут потребоваться лады большего размера. Если ноты звучат шумно или неточно, возможно, виноваты слишком низкие лады. С другой стороны, слишком высокие лады могут помешать правильной интонации.Но подъем гитарного строя может оказаться более дешевым решением последней проблемы, чем замена лада.

• Почему лады расшатываются: Износ из-за контакта со струной, сушки грифа и сотрясений в середине выступления или во время транспортировки может привести к расшатыванию ладов. А если переплет теряет влагу, концы ладов могут приподняться или обнажиться. Все это создает проблемы, которые можно ошибочно списать на более типичную проблему износа накладок, но в этих случаях переодевание или замена не обязательно являются решением.Если осталось достаточно проволоки для лада, свободный лад можно снова вставить в его прорезь вдоль грифа, и опытный мастер может заполнить промежутки между связкой и концом лада.

• Как работают веерные лады: Вы, вероятно, видели таких исполнителей, как джазовый виртуоз Чарли Хантер, играющий на инструментах, у которых лады разложены веером вдоль грифа. Цель размещения веерных ладов — придать нижним струнам большую длину, а верхним — меньшей, тем самым обеспечивая более точную настройку и глубокие басы.Раздутые лады могут показаться новинкой, но впервые они появились в 16, ^-м,-м веке.

• Не всегда обвиняйте лады: Жужжание не обязательно означает наличие проблемы с ладом. Некоторые гитаристы в стремлении к скорости устанавливают мосты для сверхнизких звуков, и это может вызвать у лада жужжание. Для новичков, незнакомых с тем, как точно звучат струны, или для более опытных игроков, впервые исследующих открытые и выпадающие строчки, жужжание также может стать настоящим убийством.Низкие строчки, такие как опущенное D, открытое D и открытое C, могут побудить гитары с нормальным действием к гудению из-за провисания струн, если гитара не настроена должным образом, чтобы приспособиться к таким строчкам.

Разработчики чистых технологий беспокоятся о колдовском часе за гранты Министерства энергетики США

НЬЮ-ЙОРК. Спустя два с половиной года после банкротства Lehman Brothers Holdings Inc., Уолл-стрит оказалась в штопоре. По мнению экспертов, финансирование проектов в области ветроэнергетики, солнечной энергии и других экологически чистых источников энергии по-прежнему затруднено.

Сделки заключаются, но не такими темпами, которые отрасль назвала бы надежными, и многие разработчики проектов все еще зависят от временных мер государственной поддержки.

Растет беспокойство по поводу предстоящего завершения программы Министерства энергетики, которая позволяет проектам требовать денежные гранты вместо налоговых льгот, которые в течение многих лет были основой финансирования проектов в области возобновляемых источников энергии.Инсайдеры берут на себя производство налоговые льготы и инвестиционные налоговые льготы вернутся в следующем году, но большинство также согласны с тем, что гранты закончатся 31 декабря. Возникает большой вопрос: могут ли проекты перейти от грантов к кредитам?

«Когда это произойдет, что будет дальше?» сказал Джек Джейкобс, управляющий партнер Cleantech Law Partners, фирмы, которая специализируется на организации финансирования проектов в области чистых технологий.»Это действительно вопрос, над которым, как мне кажется, многие разработчики спрашивают, потому что нет той последовательности, которая нам действительно нужна от федерального правительства прямо сейчас ».

Джейкобс говорит, что картина не совсем мрачная. Проекты все еще строятся, и он особенно оптимистичен по поводу возможностей распределенных программ солнечной энергии и ветровых проектов, частично финансируемых общественными организациями.

Но он признает, что до сих пор денежные гранты были источником жизненной силы для многих проектов в области возобновляемых источников энергии. Разработчики, с которыми он работает, не совсем знают, есть ли у банков аппетит к продолжению поддержки в следующем году, снова полагаясь в основном на так называемые налоговые платежи. структуры долевого финансирования, которые позволяют им запрашивать налоговые льготы для компенсации обязательств по более прибыльным бизнес-потокам.

У разработчиков будет множество возможностей оценить настроения банков в ближайшие недели, когда по Нью-Йорку пройдет серия конференций по экологически чистой энергии, начиная с завтрашнего саммита Wall Street Green Summit, который проходит уже 10 лет. Два других соревнующихся Мероприятия предоставят компаниям альтернативной энергетики возможность взвесить свои варианты после истечения срока действия программы денежных грантов.

Большинство компаний продолжают стремиться к более сильной и последовательной государственной поддержке, помимо временных налоговых льгот, которые иногда продлеваются всего за несколько дней до истечения срока их действия. Джейкобс и другие настаивают на том, что национальный зеленый тариф творить чудеса для производства и распределения чистой энергии внутри страны.

Индустрия чистых технологий давно требует установления цены на углекислый газ, выделяемый при сжигании ископаемого топлива, но с разговорами о всеобъемлющем U.S. Законодательство об изменении климата теперь мертво, должностным лицам отрасли придется рассмотреть другие варианты во время их принятия. говорит здесь.

Ключевые финансисты

Но разработчикам проектов, возможно, не придется слишком беспокоиться, если некоторые из более крупных и более преданных финансистов сохранят заявленную поддержку.

GE Energy Financial Services, один из крупнейших игроков в этой области, заявляет, что достиг своей цели по достижению 6 миллиардов долларов своего инвестиционного портфеля, привязанного к инвестициям в возобновляемые источники энергии, в конце 2010 года. Но эти расходы были распределены между 14 странами, и 75 процентов внутренних расходов были сосредоточены на штатах со стандартами портфеля возобновляемых источников энергии или законами, которые обязывают получать определенный процент электроэнергии из возобновляемых источников.

Тем не менее, эта фирма заявляет, что намерена и дальше поддерживать альтернативную энергетику в Соединенных Штатах, но только федеральное правительство демонстрирует аналогичную приверженность. «Мы призываем Конгресс ввести в действие долгосрочные и предсказуемые возобновляемые источники энергии. политики «, — сказал генеральный директор GE Energy Financial Services Алекс Уркхарт в пресс-релизе.

Представитель JP Morgan Chase Энн Мари Хаузер сообщила, что инвестиции ее фирмы в проекты альтернативной энергетики в США составили 3 доллара. 2 миллиарда в прошлом году. Деньги пошли на четыре проекта геотермальной энергетики, 67 ветряных электростанций и 12 фотоэлектрических проекты солнечной энергетики.

Все эти механизмы были структурами налогового равноправия, и хотя Хаузер не уточнила, были ли задействованы гранты Министерства энергетики США каким-либо образом, она сказала, что ее фирма, вероятно, продолжит свою поддержку до тех пор, пока Конгресс сохраняет налоговые льготы и другие льготы. место.

«JP Morgan Chase — один из крупнейших инвесторов в налогообложение ветроэнергетики в США, и компания планирует и дальше расширять свою налоговую инвестиционную деятельность в секторах возобновляемой и чистой энергии по мере появления новых возможностей», — сказала она.

В глобальном масштабе 2010 год стал рекордным годом для инвестиций в альтернативную энергетику, рост почти полностью обеспечивался за счет государственных расходов на стимулирование экономики, особенно в Китае.

Некоторые считают, что с возвращением цен на нефть в размере 100 долларов за баррель в этом году расходы банков на возобновляемые источники энергии превысят показатели 2010 года, даже если прямое государственное субсидирование ускользнет.

Эксперты прогнозируют, что более широкое внедрение финансирования альтернативной энергетики во главе с JP Morgan Chase и другими должно привести к появлению других игроков, особенно если экономика будет хорошо расти и прибыльность банков продолжит расти.

Требуется правительственный сигнал

Но отрасль по-прежнему столкнется со значительными встречными ветрами.

Фил Спектор, поверенный из практики чистых технологий Troutman Sanders LLP, сказал, что даже в 2010 году многим застройщикам все еще не удавалось получить денежные средства на период строительства, который не получил никаких прямых стимулирующих расходов. И время и ресурсы Требование к управлению структурой налоговой справедливости означало, что проекты должны были быть достаточно большими, чтобы оправдать эти дополнительные затраты, исключая многие в остальном достойные проекты.

Эксперты также говорят, что автономные проекты также проигрывают разработчикам, которые имеют большой послужной список и большой поток разработок в разработке. И банки по-прежнему отдают предпочтение ветру и солнечной энергии по сравнению с другими инновационными системами альтернативной энергетики.Но Спектор сказал, что видит свет в конце туннеля.

«По мере того, как сделки становятся более стандартизированными и имеют опыт работы с крупными игроками, на рынок, вероятно, выйдет больше банков и других кредиторов и инвесторов», — сказал Спектор.

Тем не менее, он согласился с тем, что отрасли нужен более четкий сигнал поддержки со стороны правительства, чтобы банки действительно заинтересовались.«Одним из источников беспокойства является бездействие правительства», — сказал он

Джейкобс из Cleantech Law Partners и другие хотели бы, чтобы программа денежных грантов была расширена или, по крайней мере, заменена чем-то более надежным, чем просто возврат к базовой налоговой кредитной поддержке, например, федеральным льготным тарифом.

«Без этого мы просто будем спотыкаться очень-долго», — сказал Джейкобс.

Black Fret Сиэтл — Black Fret

Black Fret — 501 (c) 3 Общественная благотворительная организация, основанная в Остине, штат Техас, в 2013 году, которая поддерживает создание и исполнение местной музыки. Мы считаем, что местная музыка — это искусство, достойное поддержки общества, точно так же, как симфония и опера поддерживались поколениями. Наша миссия — способствовать созданию и исполнению новой музыки выдающимися местными музыкантами Сиэтла. Наше видение — построить благотворительное учреждение, способное поддерживать более миллиона долларов в год в виде грантов для музыкантов из Сиэтла.

С момента своего создания Black Fret распределил более 1,7 миллиона долларов в виде грантов и гонораров за выступления музыкантам Остина. Сиэтл — вторая глава Black Fret по мере перехода к национальной модели.

Black Fret предоставляет участникам серию уникальных музыкальных впечатлений, где они могут стать свидетелями лучшей и яркой развивающейся местной музыки.Члены также участвуют в годичном процессе присуждения наград, чтобы выдвинуть кандидатуры и проголосовать для определения распределения грантовых долларов совместно с консультативным советом музыкальной индустрии. Гранты на первый сезон в Сиэтле будут присуждены в январе 2021 года.

«Мне нравится, когда поддерживают новых / начинающих художников! С нетерпением ждем, когда Black Fret Seattle оставит свой след в Сиэтле. Я полностью поддерживаю это! » — Майк Маккриди, Pearl Jam

«Как давний член музыкального сообщества Сиэтла, меня привлекла модель Black Fret и то влияние, которое она может оказать на поддержку музыкантов нашего региона», — сказал исполнительный директор Black Fret Seattle Бен Лондон.«Я понимаю проблемы, с которыми сталкиваются наши музыканты, пытаясь работать и жить в быстро меняющемся городе. Без дополнительной поддержки один из наших самых ценных природных ресурсов может испариться на наших глазах ».

Black Fret был основан Колином Кендриком и Мэттом Оттом, которые осознали культурную ценность и опасность всемирно признанной живой музыки в Остине. «Мы создали Black Fret как меломаны. Мы любим музыку, которую производит наш город, и хотели найти способ поддержать талантливых, трудолюбивых местных музыкантов, знакомя их с новой аудиторией », — сказал Колин. «Музыкальная сцена Сиэтла легендарна и была источником вдохновения для Остина».

«В то время как проблемы, с которыми сталкиваются местные музыканты во многих крупных музыкальных городах, схожи, в культурном отношении Сиэтл был очевидным выбором для нашей второй главы», — сказал Мэтт, соучредитель Black Fret. «Мы очень благодарны музыкальному сообществу Сиэтла за страстный отклик и очень рады очень скоро увидеть наш первый класс номинантов Black Fret в Сиэтле».

«Заработать на жизнь в качестве музыканта может быть особенно сложно во времена консолидации лейблов, падения продаж и потоковых сервисов… (Black Fret) пытаются изменить это, привнося модель патронажа в симфоническом стиле в местную популярную музыку.»- Журнал Forbes

ПРАВО:

Сиэтлские группы и исполнители могут представить свою музыку вниманию Black Fret, заполнив форму на blackfret.org/listenup. Члены Black Fret и другие составляющие, такие как Консультативный совет Black Fret в Сиэтле, а в последующие годы музыканты, получившие гранты Black Fret, номинируют музыкантов и группы, чтобы стать номинантами Black Fret. Таким образом, музыканты не могут сами подавать заявки на гранты Black Fret, но выбираются участниками Black Fret в рамках нашего ежегодного процесса номинации.Конечно, Black Fret никогда не взимает плату за подачу и не взимает никаких сборов с музыкантов.

Артисты, имеющие право на номинацию и получение грантов от Black Fret Seattle, — это группы или отдельные музыканты, у которых (1) как минимум 50% участников группы указывают свое основное местожительство в своих личных налоговых декларациях как находящиеся в пределах 100 миль от Сиэтла, штат Вашингтон, (2) квалифицируются как малый бизнес в соответствии со стандартами Управления малого бизнеса США для музыкальных групп и артистов, и (3) не являются ближайшими членами совета директоров Black Fret.

ПРИСОЕДИНЯЙТЕСЬ К США

Ваше членство позволяет Black Fret усилить свое влияние на музыку Сиэтла — независимо от количества мероприятий, которые вы посещаете, или вашего уровня участия в процессе выбора артиста. В течение следующего десятилетия мы профинансируем сотни групп и поставим тысячи новых песен, построив новое учреждение в Сиэтле, способное поддерживать устойчивый художественный, культурный и экономический рост Сиэтла и артистов, которые называют наш город своим домом.

Присоединяйтесь к нам в создании этого наследия.

Ладная работа для бедняков: 13 шагов (с картинками)

Я снова достаю вращающийся инструмент и использую отрезной круг. плоской стороной колеса я стараюсь медленно шлифовать лад заподлицо с креплением. ИДТИ ОЧЕНЬ МЕДЛЕННО! Также работает на нескольких ладах одновременно. Это поможет вам не перегреть лад и не расплавить переплет под ладом. (Я проделывал это несколько раз) Так что работайте примерно с 4 ладами одновременно. Немного измельчите по одному, затем переходите к следующему и так далее.Делайте это до тех пор, пока лад не будет на одном уровне с переплетом. Я также время от времени немного подкручивал привязку с помощью отрезного круга. Но это не влияет на играбельность инструмента. Если вы немного зачистили переплет, воспользуйтесь небольшим напильником или наждачной доской, чтобы немного разгладить его.

Примечание: если вы горите под ладом, воспользуйтесь герметиком или другим наполнителем, чтобы заполнить небольшой зазор. Опять же, я делал это несколько раз, но это не повлияло на игровые возможности. Может быть, вы можете придумать для этого лучший метод, например, запиливание ладов вручную.

Теперь вам нужно сделать фаску на концах ладов. Снова использую отрезной круг. Большинство скосов ладов составляют 30 градусов. Многие люди, которые повторно ладят на своих инструментах, перескакивают (я делал на своем первом инструменте на двух ладах … Мне удалось вытащить их и вставить пару новых ладов очень быстро … проблема была решена отлично) .

Итак, когда вы снимаете фаску, двигайтесь медленно, работайте на 3 или 4 ладах за раз, чтобы избежать перегрева и не перегибать кромку.

Теперь меняю отрезной круг на шлифовальный диск (рис. 2).Это удалит мелкие заусенцы и поможет немного придать форму кончикам ладов и скруглить их.

Пальцами проверьте, нет ли на ладу острых частей. Ты их найдешь, тщательно отшлифуй их тупо.

После шлифовки он должен выглядеть как на фото №3.

Теперь я снимаю шлифовальный диск и использую насадку для полировальной ткани и полировальную пасту (обычно идет в комплекте с вращающимся инструментом). Я не представлял себе этого. У меня есть еще одна гитара, над которой нужно поработать, так что я получу картину, когда буду полировать эти лады.В любом случае, с помощью тканевой насадки и пасты отполируйте каждый лад. Уделите особое внимание ладу на концах , где вы выполняли большую часть шлифовки и шлифования, поэтому удалите еще заусенцы и отполируйте.

Количественная коэкспрессия белков на уровне отдельных клеток — применение к мультимерному датчику FRET

Абстрактные

Фон

Коэкспрессия белков обычно достигается путем введения двух (или более) независимых плазмид в клетки, каждая из которых управляет экспрессией другого представляющего интерес белка. Однако относительные уровни экспрессии могут сильно различаться между отдельными клетками и не могут контролироваться. В идеале коэкспрессия происходит при определенном соотношении, которое постоянно среди клеток. Эта особенность особенно важна для количественных исследований отдельных ячеек, особенно тех, которые используют бимолекулярные датчики Фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET).

Методология / основные выводы

Были выбраны четыре стратегии коэкспрессии, основанные на котрансфекции, плазмида с двойным промотором, внутренний сайт входа в рибосомы (IRES) и вирусный пептид 2A.Была проведена количественная оценка совместной экспрессии двух спектрально разделяемых флуоресцентных белков в отдельных живых клетках. Показано, что пептидная стратегия 2А может использоваться для устойчивой эквимолярной коэкспрессии, в то время как последовательность IRES допускает экспрессию двух белков в соотношении приблизительно 3: 1. Комбинированные элементы 2A и IRES были использованы для создания единой плазмиды, которая управляет экспрессией трех отдельных белков, которая генерирует датчик FRET для измерения активации гетеротримерного G-белка. Плазмида управляет коэкспрессией донорных и акцепторных субъединиц с пониженной гетерогенностью и может использоваться для измерения активации G-белка в отдельных живых клетках.

Выводы / Значение

Количественная коэкспрессия двух или более белков может быть достигнута при небольшой межклеточной изменчивости. Это открытие делает возможным надежную совместную экспрессию донорных и акцепторных меченых белков для исследований FRET, что особенно важно для разработки новых бимолекулярных сенсоров, которые могут быть экспрессированы из одной плазмиды.

Образец цитирования: Goedhart J, van Weeren L, Adjobo-Hermans MJ, Elzenaar I., Hink MA, Gadella TW Jr (2011) Количественная коэкспрессия белков на уровне отдельных клеток — применение к мультимерному датчику FRET. PLoS ONE 6 (11): e27321. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0027321

Редактор: Анна Мария Дельпрато, Европейский институт химии и биологии, Франция

Поступила: 30 мая 2011 г . ; Одобрена: 13 октября 2011 г .; Опубликовано: 17 ноября 2011 г.

Авторские права: © 2011 Goedhart et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана инвестиционным грантом Middelgroot (834.09.003) Нидерландской организации научных исследований (NWO). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Генетически закодированные биосенсоры на основе резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET) открыли новое понимание пространственных и временных аспектов белковых взаимодействий или конформаций в широком спектре клеточных процессов [1], [2]. Эти сенсоры часто состоят из двух взаимодействующих белков или белка и взаимодействующего домена, зажатого между донорным и акцепторным флуорофором.Изменения во взаимодействии или конформации приводят к FRET, который количественно оценивается и используется для считывания. Мономолекулярные сенсоры являются предпочтительными, поскольку (i) они экспрессируются из одной плазмиды и (ii) соотношение YFP и CFP является постоянным среди клеток, что упрощает количественную оценку FRET [3]. Однако мономолекулярные сенсоры требуют, чтобы два взаимодействующих белка или домена были физически связаны, что не всегда возможно из-за структурных ограничений или посттрансляционных модификаций на C- или N-конце [4].В таких случаях два взаимодействующих белка, слитых с донорными и акцепторными флуорофорами, необходимо экспрессировать отдельно. Преимущество бимолекулярных сенсоров состоит в том, что динамический диапазон потенциально больше, поскольку белки физически разделены в отсутствие взаимодействия и, следовательно, нет базового FRET в невзаимодействующем состоянии [5], [6], [7] .

Для достижения совместной экспрессии (флуоресцентных) белков в одной клетке белки обычно экспрессируются из отдельных плазмид, которые просто смешиваются в процедуре трансфекции.Основным недостатком этого подхода является то, что белки экспрессируются в широком диапазоне соотношений, а субпопуляция клеток экспрессирует только одну из двух конструкций, что затрудняет исследования FRET. Другой недостаток состоит в том, что для развития стабильно экспрессирующих клеток или организмов требуется по крайней мере два независимых события трансформации, практически без какого-либо контроля над соотношением донор-акцептор. Чтобы решить эти проблемы, мы решили оценить эффективность нескольких стратегий надежной коэкспрессии белков в определенном соотношении в отдельных живых клетках.Мы обнаружили, что IRES и вирусные пептиды 2A можно использовать для совместной экспрессии белков в фиксированном соотношении на уровне отдельных клеток.

Впоследствии мы использовали эти стратегии для достижения экспрессии мультимолекулярного сенсора FRET, который измеряет активацию гетеротримерного G-белкового комплекса из одной плазмиды. Сенсор FRET состоит из трех белков (Gαq с меткой CFP, Gβ с меткой YFP и Gγ с меткой YFP), которые ранее экспрессировались с использованием трех отдельных плазмид [4]. Была достигнута устойчивая коэкспрессия субъединиц, меченных CFP и YFP, из одной плазмиды, и ее использовали для измерения активации G-белка в отдельных живых клетках с ограниченными межклеточными вариациями отношения FRET.

Результаты

Несколько стратегий позволяют коэкспрессировать белки в (близком к) эквимолярном соотношении, что подтверждается биохимическими анализами клеточных популяций. Поскольку неясно, как эти стратегии работают в отдельных клетках, мы решили коэкспрессировать два почти идентичных репортерных белка CFP и YFP (на 98,6% идентичны на уровне нуклеотидов и на 97,5% на уровне белка), используя несколько стратегий, и оценить их эффективность на уровне одноклеточный уровень. Сначала проводили обычное смешивание равных количеств плазмиды, кодирующей соответственно вариант CFP mTurquoise [8] и вариант YFP mVenus (L68V) [9], с последующей трансфекцией. Количественная оценка флуоресценции отдельных клеток в каналах CFP и YFP показала заметную гетерогенность в соотношении экспрессии CFP и YFP (, фиг. 1A, ). Эти результаты согласуются с предыдущими наблюдениями, и предполагается, что изменение вызвано ограниченным количеством плазмид, которые в конечном итоге окажутся в ядре [10].

Рис. 1. Характеристика различных стратегий коэкспрессии путем количественной оценки голубого флуоресцентного белка и желтого флуоресцентного белка флуоресценции из отдельных клеток.

Анализируются четыре различных стратегии коэкспрессии: смешивание двух плазмид (A), двух промоторов на одной плазмиде (B), внутреннего сайта входа в рибосому (C) и последовательности пептида, расщепляемого вирусом 2A (D). В верхнем ряду схематично изображены использованные плазмиды. Вторая и третья строки показывают анализ флуоресценции CFP по сравнению с флуоресценцией YFP на основе отдельных клеток (в произвольных единицах) в двух возможных ориентациях. Точки представляют данные об интенсивности флуоресценции для одной клетки. Набор данных был помещен в линейную линию в качестве наглядного пособия.На графике показан квадрат коэффициента корреляции r ².

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0027321.g001

Мы пришли к выводу, что экспрессия CFP и YFP из одной плазмиды дает клетки, коэкспрессирующие белки в постоянном соотношении. Сначала была протестирована плазмида с двойным промотором, предназначенная для экспрессии двух индивидуальных белков. Экспрессия CFP и YFP управлялась промоторами CMV и EF-1alpha соответственно. Анализ флуоресценции CFP по сравнению с YFP показал поразительную гетерогенность, которая была аналогична той, которая наблюдалась при стратегии смешения плазмид (, фиг. 1B, ).

Последовательность IRES широко используется для совместной экспрессии двух белков с одного промотора. Известно, что уровень белка, транслируемого с последовательности IRES, ослаблен по сравнению с уровнем экспрессии белка, расположенного выше по течению. Относительное содержание двух белков зависит от используемой последовательности IRES. Сообщается, что ECMV IRES относительно эффективен как при биохимическом анализе с антителами, так и на живых клетках с использованием флуоресцентной микроскопии [11]. Таким образом, ECMV IRES был протестирован в эксперименте по совместной экспрессии.Совместная экспрессия CFP и YFP наблюдалась во всех проанализированных клетках, и уровень белка, экспрессируемого IRES, был снижен. Важно отметить, что существует сильная корреляция между экспрессией CFP и YFP на уровне отдельных клеток ( Рисунок 1C ).

Вирусные пептиды 2A представляют собой пептидные последовательности из примерно 20 аминокислот, которые используются вирусами для экспрессии двух белков на равных уровнях [12], [13]. Гипотеза заключается в том, что рибосома останавливается во время трансляции, что приводит к неэффективному образованию пептидной связи.Рибосома продолжается, и, следовательно, образуются два отдельных белка вместе с небольшой фракцией слитого белка. Чтобы исследовать, можно ли использовать эту стратегию для совместной экспрессии флуоресцентных белков, мы слили CFP и YFP с пептидным линкером 2A в двух возможных ориентациях, то есть CFP-2A-YFP и YFP-2A-CFP. В качестве контроля была представлена неразборная версия (CFP-XX-YFP и YFP-XX-CFP). Анализ коэкспрессии показал отличную корреляцию между экспрессией CFP и YFP в отдельных клетках (, рис. 1D, ), без явной зависимости от ориентации CFP и YFP.

Разделение белков определяли количественной оценкой эффективности FRET с помощью микроскопии визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM). В случае слитого белка должна быть эффективная FRET между CFP и YFP, на что указывает уменьшенное время жизни CFP в возбужденном состоянии, в то время как FRET не ожидается, когда молекулы CFP и YFP не связаны. Действительно, мы наблюдали сокращение срока службы неразъемных элементов управления с эффективностью FRET около 20%. Разделяемые версии, CFP-2A-YFP и YFP-2A-CFP, не показали уменьшения срока службы CFP, что указывает на отсутствие FRET (, таблица 1, ), что согласуется с предыдущими наблюдениями [13]. Отсутствие FRET указывает на эффективное разделение CFP и YFP.

Установив, что и IRES, и стратегия вирусного пептида 2A могут использоваться для экспрессии двух белков с сильной корреляцией между их соответствующими уровнями экспрессии, мы определили относительные концентрации двух белков. Поскольку сделать это точно с помощью флуоресцентной микроскопии довольно сложно, мы решили использовать FCS для клеточных экстрактов, поскольку он позволяет количественно определить количество флуоресцентных молекул в калиброванном элементе объема.В случае FRET количество молекул донора будет уменьшено, но это не повлияет на количество молекул, которые обнаруживаются в элементе объема.

Мы обнаружили стехиометрическую экспрессию CFP и YFP, когда неразделимые слияния CFP-XX-YFP и YFP-XX-CFP были проанализированы, что свидетельствует о полном созревании обоих белков. Последующий анализ конструкций CFP-2A-YFP и YFP-2A-CFP выявил равную экспрессию CFP и YFP (, таблица 2, ). Анализ взаимной корреляции с помощью FCCS [14] сигналов CFP и YFP показал существенный сигнал для неотделимого контроля CFP-YFP, указывающий на присутствие слитого белка, в то время как в конструкциях 2A и конструкциях IRES не было обнаружено взаимной корреляции, что указывает на экспрессию. отдельных белков (данные не показаны).

В случае анализа FCS CFP и YFP, экспрессируемых из плазмид с помощью IRES, наблюдалась четкая ориентационная зависимость с 2,5–3-кратным повышением кэп-зависимой экспрессии флуоресцентного белка по сравнению с нижележащим флуоресцентным белком, который экспрессируется из IRES ( Таблица 2 ). Вместе наши результаты показывают, что последовательности 2A и IRES могут использоваться для совместной экспрессии белков в определенном соотношении в отдельных клетках.

Гетеротримерные G-белки состоят из трех субъединиц Gα, Gβ и Gγ в комплексе 1∶1∶1 [15].Несколько групп, включая нашу, показали, что котрансфекция флуоресцентно меченных субъединиц G-белка из трех отдельных плазмид, управляющих экспрессией Gα, Gβ и Gγ, дает гетеротримерный комплекс G-белка. Более того, активацию G-белка можно отслеживать в отдельных клетках с помощью визуализации соотношения FRET [16], [17], [18], [19]. Однако, как наблюдается в любом эксперименте по котрансфекции, флуоресценция CFP по сравнению с YFP широко варьирует в зависимости от субпопуляции, экспрессирующей только одну из двух субъединиц, меченных флуоресцентным белком (, фиг. S1, ).Чтобы облегчить это ограничение, мы исследовали, можно ли экспрессировать три белка из одной плазмиды с использованием вышеупомянутых стратегий. Сначала Gβ1 был связан через вирусный пептид 2A с YFP-Gγ2. Бокс CaaX на C-конце Gγ2 необходим для модификации липидов и не переносит дополнительных аминокислот, что препятствует использованию последовательности 2A в этом сайте. Поэтому мы решили сконструировать плазмиду, которая экспрессирует Gβ1-2A-YFP-Gγ2. Поскольку линкерный пептид 2A может вводить некоторый неотделенный продукт, мы сравнили коэкспрессию Gβ1 и YFP-Gγ2 из отдельных плазмид и из плазмид, экспрессирующих Gβ1-2A-YFP-Gγ2 и неотделимый контроль, Gβ1-XX-YFP. -Gγ2.Локализация с помощью конфокальной микроскопии (, фиг. 2A, ) и вестерн-блоттинга (, фиг. 2B, ) показала, что экспрессия YFP-Gγ2 была неразличима, когда экспрессию отдельных плазмид сравнивали с экспрессией из одного Gβ1-2A-YFP-Gγ2. Обе стратегии экспрессии дали четкую локализацию YFP-Gγ2 на плазматической мембране, помимо некоторого эндомембранного мечения (, фиг. 2A, ). Напротив, неотделимый контроль локализован на эндомембранах, и не наблюдается мечения плазматической мембраны.Кроме того, он плохо выражен (данные не показаны), возможно, из-за быстрой деградации. Кроме того, вестерн-блоттинг обнаруживает слабую высокомолекулярную полосу в образце, который был трансфицирован неотделимой версией Gβ1-XX-YFP-Gγ2 (, фиг. 2B, ). Молекулярная масса соответствует размеру белка, состоящего из Gβ1, слитого с YFP-Gγ2, как и ожидалось от нерасщепляемой последовательности 2A. Низкая интенсивность согласуется с низким уровнем флуоресценции, наблюдаемой в клетках.

Рисунок 2.Анализ коэкспрессии Gβ1 и YFP-Gγ2 из одной плазмиды или отдельных плазмид.

(A) Три репрезентативных изображения локализации YFP-Gγ2 с помощью конфокальной микроскопии, экспрессированных из плазмиды, кодирующей Gβ1-2A-YFP-Gγ2, Gβ1-XX-YFP-Gγ2, или двух отдельных плазмид, Gβ1 + YFP-Gγ2. YFP-Gγ2 локализуется на плазматической мембране и эндомембранах в случае экспрессии Gβ1-2A-YFP-Gγ2 и когда Gβ1 и YFP-Gγ2 коэкспрессируются из отдельных плазмид. Неразделимый контроль Gβ1-XX-YFP-Gγ2 демонстрирует (тусклую) цитоплазматическую и эндомембранную флуоресценцию.Ширина изображений 73 мкм. (B) Вестерн-блоттинг с антителом к GFP подтверждает, что YFP-Gγ2 правильно экспрессируется из плазмиды Gβ1-2A-YFP-Gγ2 и что неотделенный продукт не обнаруживается. Белок, экспрессируемый из Gβ1-XX-YFP-Gγ2, показывает слабую полосу, которая соответствует неотделенному белку.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0027321.g002

Неповрежденные, немодифицированные C- и N-концы необходимы для биофункциональности субъединиц Gα [20] и, следовательно, запрещают использование вирусного пептида 2A. Поэтому мы решили связать экспрессию Gαq-CFP через последовательность IRES с единицей Gβ1-2A-YFP-Gγ2. Мы сконструировали две плазмиды с разной ориентацией: Gα-IRES-Gβ-2A-Gγ и Gβ-2A-Gγ-IRES-Gα. Качественно мы наблюдали улучшенную корреляцию между уровнем экспрессии Gαq-CFP и YFP-Gγ2 для клеток, которые экспрессировали меченые субъединицы из этих плазмид, по сравнению с экспрессией из отдельных плазмид (, фиг. 3A, ). Более того, как Gαq-CFP, так и YFP-Gγ2 экспрессировались во всех клетках и правильно локализовались на плазматической мембране.Количественный анализ, в котором флуоресценция YFP по сравнению с флуоресценцией CFP измерялась для YFP-Gγ и Gαq-CFP соответственно, показывает улучшенную корреляцию для систем с одной плазмидой. Наибольшая корреляция между интенсивностью CFP и YFP (r ² = 0,5) наблюдалась для плазмиды, которая экспрессирует Gβ-2A-Gγ-IRES-Gα (, фиг. S1 ). Следует отметить, что интенсивность флуоресценции CFP в этом эксперименте снижается FRET, и что клеточная аутофлуоресценция вносит вклад как в канал CFP, так и в канал YFP из-за низкой экспрессии субъединиц G-белка. Следовательно, измеренные интенсивности коррелируют с количеством молекул, но не могут быть преобразованы в количество молекул.

Рисунок 3. Характеристика сенсора FRET для мониторинга активации G-белка, экспрессируемого из одной плазмиды или нескольких плазмид.

(A) Gαq-CFP, немаркированный Gβ1 и YFP-Gγ2 были экспрессированы либо путем смешивания трех отдельных плазмид (Gα + Gβ + Gγ), либо из одной плазмиды в двух ориентациях, Gα-IRES-Gβ-2A-Gγ и Gβ. -2A-Gγ-IRES-Gα соответственно. Показаны флуоресцентные изображения клеток, показывающие локализацию и уровни экспрессии Gαq-CFP и YFP-Gγ2.Ширина изображений 177 мкм. (B) Данные визуализации соотношения FRET (возбуждение CFP и измерение YFP по отношению к интенсивности CFP), показывающие изменение среднего соотношения во времени в процентах (сплошная линия) и s.e.m. (серый цвет) клеток, трансфицированных Gα + Gβ + Gγ (n = 13), Gα-IRES-Gβ-2A-Gγ (n = 12) и Gβ-2A-Gγ-IRES-Gα (n = 12). Среднее (± sem) начальное отношение YFP / CFP, которое мы определили, составляет для Gα + Gβ + Gγ 2,1 ± 0,4, для Gα-IRES-Gβ-2A-Gγ 0,76 ± 0,03 и для Gβ-2A-Gγ-IRES-Gα, 1,5 ± 0,1. Клетки HeLa стимулировали 100 мкМ гистамина (t = 20 с), и ответ обращали, добавляя антагонист пириламин (t = 60 с).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0027321.g003

Образование гетеротримеров исследовали путем количественной оценки эффективности FRET с помощью FLIM. FLIM обеих конструкций показал уменьшенное время жизни, что указывает на образование гетеротримерного комплекса (, таблица 3, ). Эффективность FRET конструкции Gβ-2A-Gγ-IRES-Gα была почти вдвое выше по сравнению с конструкцией с обратной ориентацией, Gα-IRES-Gβ-2A-Gγ. Эффективность FRET Gβ-2A-Gγ-IRES-Gα на основе времени жизни фазы 27% была аналогична эффективности FRET, о которой сообщалось ранее при трансфекции отдельных плазмид [4].

Ранее мы использовали пару FRET Gαq-CFP / YFP-Gγ2 для логометрической визуализации для визуализации активации гетеротримерного G-белка. Когда применяют раздельную трансфекцию субъединиц, исходное соотношение YFP / CFP широко варьирует между клетками из-за различий в относительном уровне экспрессии Gαq-CFP по сравнению с YFP-Gγ2. Чтобы проверить, является ли соотношение YFP / CFP менее вариабельным в случае экспрессии из одной плазмиды, мы измерили отношения FRET в клетках, трансфицированных Gα-IRES-Gβ-2A-Gγ или Gβ-2A-Gγ-IRES-Gα, и заметили сильно уменьшенная вариация, как следует из уменьшенной стандартной ошибки среднего (, рис. 3В, ).

Мы попытались измерить относительную экспрессию Gαq-CFP и YFP-Gγ2 с помощью FCS на клеточных экстрактах, но уровни флуоресценции были слишком близки к фону. В будущих исследованиях будет рассмотрена стехиометрия комплекса G-белка в отдельных живых клетках.

Впоследствии мы контролировали активацию G-белка, отслеживая соотношение FRET и стимуляцию клеток гистамином, агонистом рецептора h2. Измерения субъединиц, экспрессируемых из нескольких плазмид, показывают наибольшую вариацию в соотношении, в то время как стратегии с одной плазмидой показывают пониженную гетерогенность (, фиг. 3B, , ). Среднее изменение соотношения было близко к 20% для образца Gα + Gβ + Gγ и Gβ-2A-Gγ-IRES-Gα, в то время как оно составляло только около 10% для образца Gα-IRES-Gβ-2A-Gγ. Более высокое изменение соотношения Gβ-2A-Gγ-IRES-Gα и более высокая начальная эффективность FRET (, таблица 3, ), скорее всего, обусловлены более благоприятным соотношением донор / акцептор. В заключение, мы демонстрируем, что экспрессия мультимерного сенсора FRET для активации гетеротримерного G-белка из одной плазмиды снижает гетерогенность в соотношении FRET между клетками, сохраняя при этом высокий динамический диапазон.

Обсуждение

Здесь мы демонстрируем, что котрансфекция двух независимых плазмид приводит к совместной экспрессии двух белков с высокими межклеточными вариациями в относительном уровне экспрессии. Подобная гетерогенность наблюдалась, когда два флуоресцентных белка экспрессировались из одного вектора с двумя промоторами. Следует отметить, что альтернативные векторы, не испытанные в этом исследовании, коммерчески доступны для совместной экспрессии двух белков. Эти отчеты предоставляют метод для тестирования их производительности на уровне отдельной ячейки. Наблюдаемые вариации проблематичны для количественных исследований отдельных клеток, особенно тех, которые используют бимолекулярные или мультимерные датчики FRET.

Два разных подхода, вирусный пептид 2A и последовательность IRES, представляют собой решение. Расщепляемый пептид 2A представляет собой элегантный способ совместной экспрессии нескольких белков на эквимолярных уровнях из одного транскрипта. По крайней мере четыре белка были коэкспрессированы с использованием этой стратегии 2A для индукции плюрипотентных стволовых клеток [21], хотя еще предстоит показать, все ли четыре белка экспрессируются на эквимолярных уровнях в отдельных клетках.Возможным недостатком пептидов 2A является небольшая фракция нерасщепленного белка, что нежелательно и может приводить к ложноположительному FRET, хотя мы не наблюдали неотделенный продукт, когда Gβ1 и Gγ2 совместно экспрессировались из плазмиды, кодирующей Gβ1-. 2A-YFP-Gγ2. Возможно, что количество нерасщепленного белкового продукта меньше в случае меченых белков, поскольку они подвержены деградации и, как правило, менее стабильны, чем немаркированные флуоресцентные белки. Другой вопрос, который следует учитывать, — это модификация N- или C-конца вставленным пептидом.

IRES дает два белка, которые полностью физически разделены и не модифицированы на C- или N-конце. Поскольку белок, расположенный выше по течению, экспрессируется примерно в 3 раза выше, чем белок ниже по течению от IRES, возможно экспрессировать донор и акцептор в соотношении 1: 3 или 3: 1. Мы демонстрируем, что эту особенность можно использовать для настройки эффективности FRET гетеротримеров. Комбинируя последовательности IRES и 2A, мы сконструировали мультимерный датчик FRET для активации G-белка, экспрессируемого из одной плазмиды.Хотя мы показываем, что можем контролировать относительные уровни экспрессии Gαq-CFP и YFP-Gγ2, следует отметить, что у нас нет контроля над скоростью деградации белка и посттрансляционных модификаций, что обычно находится вне контроля экспериментатора. Одиночная плазмида, экспрессирующая Gβ-2A-Gγ-IRES-Gα, показывает лучшее улучшение со сниженной гетерогенностью отношения FRET по сравнению с экспрессией из трех отдельных плазмид в сочетании с хорошим диапазоном ответа FRET (изменение 20%) на G -белковая активация.

В совокупности наше исследование показывает, что стратегии, основанные на 2A и IRES, обладают большим потенциалом для количественной совместной экспрессии множества белков с небольшой межклеточной изменчивостью. Эти данные будут полезны для разработки бимолекулярных генетически кодируемых сенсоров FRET, экспрессируемых из одной плазмиды. Этот тип подходов требует несколько более сложных стратегий клонирования, но упростит трансформацию клеток или организмов для стабильной экспрессии множества белков. В целом, надежные подходы коэкспрессии будут важными инструментами для количественных исследований отдельных клеток и для приложений мультиплексирования, в которых необходимо одновременно экспрессировать и визуализировать как можно больше (помеченных) белков.

Методы

Конструкция плазмиды

Для анализа коэкспрессии мы использовали два ярко видимых флуоресцентных белка (VFP), mTurquoise [8] и mVenus (L68V) [9], которые обозначены как CFP и YFP соответственно.

Вектор pBUD-CE4 был от Invitrogen (Breda, Нидерланды) и использует маркер устойчивости к зеоцину. VFP были вырезаны с использованием HindIII и XbaI из вектора VFP-N1 (Clontech) и вставлены позади промотора CMV pBUD, который был разрезан теми же ферментами.

Чтобы вставить VFP ниже EF1a, VFP амплифицировали с использованием 5′-GGAAGATCTCCACCATGGTGAGCAAGG-3 ‘и праймера rv-EF 5′-GGAAGATCTGTCGCGGCCGCTTTACTTG-3’ с плазмой VFP-N1 в качестве матрицы VFP-N1.

Продукт был разрезан с помощью BglII и вставлен в pBud, разрезанный с помощью BglII. Таким образом были изготовлены две конструкции; CMV: CFP-EF1a: YFP и CMV: YFP-EF1a: CFP.

Конструирование плазмид 2А было описано ранее [8]. Линкер 2A вставлен между кодирующими последовательностями VFP, кодирующих пептид EGRGSLLTCGDVEENPGPGS.Две плазмиды сконструированы CFP-2A-YFP и YFP-2A-CFP. Мутировавший нерасщепляемый линкер кодирует EGRGSLLTCGDVEENAAPGS, и две плазмиды на основе этого линкера обозначены как CFP-XX-YFP и YFP-XX-CFP.

Вектор pPRIG-IRES [11], который несет последовательность ECMV IRES, был получен от Патрика Мартина. Последовательность IRES амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймера fw-IRES 5′-CTAGCTAGCGCCACCATGGAGATCTGGGCCCCTATAGTGTCAC-3 ‘и праймера rv-IRES 5′-CGCGGATCCGGTTGTGGCCATATTATC-3’. Вектор Clontech-C1 и амплифицированный IRES разрезали с использованием рестрикционных ферментов NheI и BamHI и лигировали.VFP вырезали из вектора pBUD с использованием BglII и лигировали перед IRES и вырезали из плазмидного вектора 2A с использованием BamHI и лигировали ниже IRES. Были созданы две конструкции CFP-IRES-YFP и YFP-IRES-CFP.

Gαq-mTurquoiseΔ6, Gβ1 и YFP-Gγ2 были описаны ранее [4] и использовались в качестве компонентов для одной плазмиды, экспрессирующей эти три белка. Клонирование плазмид, экспрессирующих Gβ1-2A-YFP-Gγ2 и Gβ1-XX-YFP-Gγ2, основано на ПЦР. Впоследствии были сконструированы две плазмиды, кодирующие либо Gαq-mTurquoiseΔ6-IRES-Gβ1-2A-YFP-Gγ2 (Gα-IRES-Gβ-2A-Gγ), либо Gβ1-2A-YFP-Gγ2-IRES-Gαq-mTurquoiseΔ6 (Gβ-2A- Gγ-IRES-Gα). Последовательности и подробные процедуры создания этих плазмид доступны по запросу.

Культура клеток и трансфекция

клеток HeLa были получены из Американской коллекции культур тканей (ATCC; Манассас, Вирджиния, США) и культивированы в среде DMEM + глутамакс (Invitrogen, # 61965), 10% FBS, пенициллин (100 Ед / мл) и стрептомицин (100 мкг / мл). мл). Клетки трансфицировали с использованием 1-2 мкл липофектамина (Invitrogen), 0,5 мкг плазмидной ДНК и 50 мкл OptiMEM на чашку 35 мм, содержащую покровное стекло Ø # 1 24 мм.

Вестерн-блот

Через два дня после трансфекции клетки из одной лунки 6-луночного планшета лизировали добавлением 200 мкл лизирующего буфера (PBS, 1% Triton X-100, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% додецилсульфат натрия) и собирали соскабливанием. . После центрифугирования 15 мкл супернатанта использовали для SDS-PAGE. Иммуномечение проводили с использованием 1-2000 антиGFP-сыворотки (Invitrogen, A6455) и 1-10 000 козьего анти-кроличьего IgG (H&L) -HRP конъюгата (Biorad, 170-6516) в качестве вторичных антител. Обнаружение проводили с помощью системы обнаружения вестерн-блоттинга Amersham (GE Healthcare RPN2132) и Hyperfilm ECL (28

8).

Флуоресцентная визуализация

Покровные стекла с клетками помещали в камеру для клеток Attofluor (Invitrogen) и погружали в среду для микроскопии (20 мМ HEPES (pH = 7,4), 137 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl ₂, 0,8 мМ MgCl ₂ и 20 мМ глюкозы). Эксперименты по визуализации флуоресценции проводили на инвертированном флуоресцентном микроскопе Zeiss 200M с использованием Zeiss Plan-Neofluar 40 × / 1.30 Ph4 масляный объектив. Свет возбуждения от ксеноновой дуговой лампы Cairn отбирался с помощью монохроматора (Cairn Research). Для голубого флуоресцентного белка использовали возбуждающий свет 420 нм (щель 30 нм), а в случае желтых флуоресцентных белков применяли возбуждающий свет 500 нм (щель 30 нм). Дополнительная фильтрация проводилась с помощью фильтра возбуждения CFP E460SP (375–460) и фильтра возбуждения YFP E520SP (375–520). Дихроичное зеркало 455DCLP и эмиссионный фильтр BP470 / 30 использовали для CFP, а дихроичное зеркало 515DCXR и эмиссионный фильтр BP535 / 30 использовали для флуоресценции YFP.Для управления оборудованием использовалось программное обеспечение Metamorph. Время экспозиции обычно составляло 100 мс для канала CFP и 50 мс для канала YFP. Получение изображений отношения FRET было выполнено при 37 ° C, как описано ранее, по крайней мере на 3 различных образцах [4].

Данные визуализации с соотношением

FRET были обработаны с помощью ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) путем количественного определения средней интенсивности флуоресценции отдельных клеток в канале CFP и YFP и вычитания фона, полученного из интересующей области без клетки.Эти данные интенсивности использовали для расчета отношения YFP / CFP. Отношение кривых времени по меньшей мере для 12 ячеек не нормализовалось, а непосредственно усреднялось, и вычислялась стандартная ошибка среднего. Данные были впоследствии масштабированы, чтобы отобразить изменение отношения FRET в процентах. Эта процедура использовалась для изображения гетерогенности измеренных нами соотношений и несколько отличается от процедуры обработки, которая обычно выполняется, в которой гетерогенность и сворачивание / созревание флуоресцентных белков компенсируется нормализацией отдельных следов CFP и YFP [ 4], [22], [23].

FLIM выполняли, как описано ранее [4], при комнатной температуре.

Коррекция и анализ изображений

Флуоресцентные изображения для количественного анализа совместной экспрессии были скорректированы по фону и затем скорректированы на затенение с использованием однородного флуоресцентного пластикового предметного стекла (Chroma). Интенсивность флуоресценции отдельных клеток определяли количественно путем построения ROI и измерения средней интенсивности флуоресценции как в каналах CFP, так и в YFP (в произвольных единицах). Все исправления и анализы были выполнены с использованием программного обеспечения ImageJ с плагином ObjectJ и макросами.Графики и аппроксимации средней CFP по сравнению с интенсивностью YFP отдельных клеток были сделаны с помощью KaleidaGraph. Коэффициент корреляции определяли с помощью Excel (функция RSQ).

FCS

Экстракты

клеток были свежеприготовлены из отдельных лунок 6-луночного планшета. Трансфицированные клетки дважды промывали холодным PBS. Клетки лизировали холодным 300 мкл PBS + 1% (об. / Об.) Triton X-100. После центрифугирования (5 мин при 16000 g) собирали 200 мкл супернатанта и экстракты разбавляли в 10–20 раз PBS + 0.01% Тритон Х-100.

Измерения проводили в 96-луночных планшетах со стеклянным дном (Whatman), помещенных наверху перевернутого лазерного сканирующего микроскопа Fluoview 1000 (Olympus), оборудованного погруженным в воду объективом 60x UPLSApo (NA 1.2). Свет импульсного лазерного диода 440 нм (Picoquant), работающего на частоте 20 МГц, объединяли с линией 514 нм непрерывного лазера Ar ⁺ (Melles-Griot), используя куб поляризующего луча на пути возбуждения. Через главное дихроичное зеркало 440/514/594 (Chroma) излучаемый свет направлялся через отверстие регулируемого размера в конфокальном блоке обнаружения Olympus в направлении выходного канала волокна.Оптическое волокно было подключено к заказному блоку обнаружения (Picoquant), содержащему два лавинных фотодиодных детектора (MPD). Дихроичное зеркало LP515 (Semrock) было помещено на пути луча для разделения испускаемого света, а эмиссионные фильтры 475/42 (CFP) и 534/30 (YFP) (Semrock) были помещены перед детекторами. Время прихода фотонов регистрировалось прибором Picoharp 300 (Picoquant).

Перед корреляцией сигналов детектора следы необработанных данных были синхронизированы по времени в SymPhoTime 5.1.3 (Picoquant) для предотвращения перекрестных помех красителей. Фотоны, поступающие в канал CFP в течение 25 нс после импульса возбуждения 440 нм, считались истинным сигналом CFP, в то время как фотоны, поступающие в канал YFP через 25–50 нс после импульса возбуждения 440 нм, вносят вклад в сигнал YFP. Сигналы были автокоррелированы, и полученные кривые были проанализированы с помощью стандартной модели триплетной диффузии [24] для получения числа частиц. Контрольные эксперименты проводились с растворами Atto425 (D = 410 м ².с ^-1) и Alexa 488 (D = 400 м ². с ^-1) для калибровки размера и перекрытия объемов обнаружения CFP, YFP. Полученные числа частиц были скорректированы на фоновый сигнал [24].

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Количественный анализ коэкспрессии YFP-Gγ2 по сравнению с Gαq-CFP. Показаны результаты для трех разных плазмид: Gα + Gβ + Gγ (r ² = 0,004), Gα-IRES-Gβ-2A-Gγ (r ² = 0.03) и Gβ-2A-Gγ-IRES-Gα (r ² = 0,5). Значения r ² в скобках представляют собой квадрат коэффициента корреляции. Точки представляют данные об интенсивности флуоресценции для одной клетки. Набор данных был помещен в линейную линию в качестве наглядного пособия.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0027321.s001

(TIF)

Благодарности

Мы благодарим сотрудников нашей лаборатории за полезные обсуждения и Marten Postma за его помощь в анализе данных.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: JG TWJG. Выполнял эксперименты: JG LvW MJWA IE MAH. Проанализированы данные: JG LvW IE MAH. Написал статью: JG TWJG.

Ссылки

1. Чудаков Д.М., Лукьянов С., Лукьянов К.А. (2005) Флуоресцентные белки как инструментарий для визуализации in vivo. Trends Biotechnol 23: 605–613.
2. Чжан Дж., Кэмпбелл Р. Э., Тинг А. Ю., Цзян Р. Ю. (2002) Создание новых флуоресцентных зондов для клеточной биологии.Nat Rev Mol Cell Biol 3: 906–918.
3. Miyawaki A (2003) Визуализация пространственной и временной динамики внутриклеточной передачи сигналов. Dev Cell 4: 295–305.
4. Adjobo-Hermans MJ, Goedhart J, van Weeren L, Nijmeijer S, Manders EM, et al. (2011) Визуализация в реальном времени активации гетеротримерного G-белка Gq в живых клетках. BMC Biology 9: 32.
5. Мияваки А., Ллопис Дж., Хайм Р., Маккаффери Дж. М., Адамс Дж. А. и др. (1997) Флуоресцентные индикаторы Ca2 + на основе зеленых флуоресцентных белков и кальмодулина.Nature 388: 882–887.
6. van der Wal J, Habets R, Varnai P, Balla T, Jalink K (2001) Мониторинг индуцированной агонистом активации фосфолипазы C в живых клетках с помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии. J Biol Chem 276: 15337–15344.
7. Мияваки А. (2011) Разработка зондов для клеточных функций с использованием флуоресцентных белков и передачи энергии флуоресцентного резонанса. Анну Рев Биохим.
8. Goedhart J, van Weeren L, Hink MA, Vischer NO, Jalink K и др.(2010) Ярко-голубые флуоресцентные варианты белков, идентифицированные с помощью скрининга времени жизни флуоресценции. Nat Методы 7: 137–139.
9. Kremers GJ, Goedhart J, van Munster EB, Gadella TW Jr (2006) Голубые и желтые суперфлуоресцентные белки с улучшенной яркостью, сворачиванием белков и радиусом Форстера FRET. Биохимия 45: 6570–6580.
10. Schwake G, Youssef S, Kuhr JT, Gude S, David MP, et al. (2010) Прогностическое моделирование невирусного переноса генов. Biotechnol Bioeng 105: 805–813.
11. Martin P, Albagli O, Poggi MC, Boulukos KE, Pognonec P (2006) Разработка нового бицистронного ретровирусного вектора с сильной активностью IRES. BMC Biotechnol 6: 4.
12. de Felipe P (2004) Пропуск проблемы коэкспрессии: новая технология 2A «CHYSEL». Genet Vaccines Ther 2: 13.
13. Шимчак А.Л., Уоркман С.Дж., Ван Й., Виньяли К.М., Дилиоглу С. и др. (2004) Коррекция мультигенного дефицита in vivo с использованием одного ретровирусного вектора на основе «саморасщепляющегося» пептида 2А.Nat Biotechnol 22: 589–594.
14. Haustein E, Schwille P (2007) Флуоресцентная корреляционная спектроскопия: новые вариации установленной техники. Анну Рев Биофиз Биомол Структура 36: 151–169.
15. Wettschureck N, Offermanns S (2005) G-белки млекопитающих и их специфичные для клеточного типа функции. Physiol Rev 85: 1159–1204.
16. Bunemann M, Frank M, Lohse MJ (2003) Активация белка Gi в интактных клетках связана с перестройкой субъединиц, а не с диссоциацией.Proc Natl Acad Sci U S A 100: 16077–16082.
17. Гибсон С.К., Гилман А.Г. (2006) Субъединицы Gialpha и Gbeta определяют селективность активации G-белка альфа2-адренорецепторами. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 212–217.
18. Janetopoulos C, Jin T, Devreotes P (2001) Опосредованная рецептором активация гетеротримерных G-белков в живых клетках. Наука 291: 2408–2411.
19. Jensen JB, Lyssand JS, Hague C, Hille B (2009) Изменения флуоресценции выявляют кинетические этапы модуляции фосфоинозитидов и Kv7, опосредованной мускариновыми рецепторами.2 / 7,3 тыс. + Каналов. J Gen Physiol 133: 347–359.
20. Hughes TE, Zhang H, Logothetis DE, Berlot CH (2001) Визуализация функционального слияния флуоресцентного белка Galpha q-green в живых клетках. Ассоциация с плазматической мембраной нарушается мутационной активацией и устранением сайтов пальмитоилирования, но не активацией, опосредованной рецепторами или AlF4. J Biol Chem 276: 4227–4235.
21. Каджи К., Норрби К., Пака А., Милейковский М., Мохсени П. и др.(2009) Безвирусная индукция плюрипотентности и последующее удаление факторов репрограммирования. Природа 458: 771–775.
22. Gallegos LL, Kunkel MT, Newton AC (2006) Нацеливание репортера активности протеинкиназы C на дискретные внутриклеточные области выявляет пространственно-временные различия в агонист-зависимой передаче сигналов. J Biol Chem 281: 30947–30956.
23. Verbeek DS, Goedhart J, Bruinsma L, Sinke RJ, Reits EA (2008) Гамма-мутации PKC при спиноцеребеллярной атаксии типа 14 влияют на доступность домена C1 и активность киназы, приводя к аберрантной передаче сигналов MAPK.J Cell Sci 121: 2339–2349.
24. Maeder CI, Hink MA, Kinkhabwala A, Mayr R, Bastiaens PI, et al. (2007) Пространственная регуляция активности киназы Fus3 MAP посредством механизма реакции-диффузии в передаче сигналов феромона дрожжей. Nat Cell Biol 9: 1319–1326.

Мониторинг структурных изменений микроэмульсий in situ в моделируемых желудочно-кишечных условиях с помощью SAXS и FRET

Abstract

Микроэмульсии представляют собой многообещающие системы доставки лекарств для перорального введения слаборастворимых в воде лекарственных средств.Однако эволюция микроэмульсий в желудочно-кишечном тракте до сих пор плохо изучена, особенно структурные изменения микроэмульсий под действием липазы и слизи. Чтобы лучше понять судьбу микроэмульсий в желудочно-кишечном тракте, мы применили малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (SAXS) и флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) для мониторинга структурных изменений микроэмульсий под действием липолиза и слизи. Во-первых, влияние липолиза на микроэмульсии было изучено методом SAXS, который обнаружил образование жидкокристаллических фаз.Между тем, спектры FRET показали, что во время липолиза образовывались мицеллы с меньшим размером частиц, на которые могли влиять CaCl ₂, соли желчных кислот и лецитин. Затем изучали влияние слизи на изменение структуры липолизованных микроэмульсий. Результаты SAXS и FRET показали, что жидкокристаллические фазы исчезли и образовалось больше мицелл. Таким образом, мы изучили структурные изменения микроэмульсий в смоделированных желудочно-кишечных условиях с помощью SAXS и FRET и успешно отслеживали появление и исчезновение жидкокристаллических фаз и мицелл.

Графический реферат

Методы малоуглового рентгеновского рассеяния (SAXS) и флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) были применены для мониторинга структурных изменений микроэмульсий под действием липолиза и слизи. Мы обнаружили, что жидкокристаллические фазы и мицеллы появлялись при липолизе, а жидкокристаллические фазы исчезали в слизи.

Загрузить: Загрузить изображение в высоком разрешении (295KB)
Загрузить: Загрузить полноразмерное изображение

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА

Микроэмульсии

SAXS

FRET

Липолиз

Кристаллическая слизь

статьиЦитирующие статьи (0)